太谷核不育基因s2的分子生物学研究.pdf

太谷核不育基因ms2的分子生物学研究 摘 要 太谷核不育小麦是我国1972年发现的’一份珍贵小麦材料，其独特之处主要 表现在：其不育性受显’陛单基因摔制，雄州·小育彻底，至今未发现一例自交结实 现象；雄性不育稳定，不受环境条件的影响：不育性只受显性基因ms2控制， 不受遗传背景的影响。它是世界上发现的第一份小麦显性核不育材料．具有巨大 的经济价值和理论研究价值。在此基础上育成的矮败小麦是具有矮秆基因标记的 显性核不育材料，其显性不育基因ms2与显性矮秆基因RhtlO紧密连锁，二者之 恻的连锁交换率不超过018％。本研究所用材料为以中国春为轮回亲本连续回交 十二代的矮败中国春小麦近等基因系，该近等摹因系的高杆可育及矮杆不育株除 在育性、株高上存在差异外，其它遗传背景相同，是进行各项分子生物学研究的 好丰爿料。 利用拟南芥中已克隆的雄性核不荇基因Ms2和水稻中假定雄性不育蛋白的 保守区域，设计埘简并引物MSP，在太谷核不育小麦可育株及不育株花药中 扩埔H{了一条134bp的片段，序列分析发玑哦片段在可育及不育花药eDNAl剞 没有差异。该序列11三予延伸得到一个睦为1。604bp的小麦Contig，序列比较发现． 浚拼接Contig推测编码的氨基酸序列包含有一段由200个氨基酸纳成的雄性不 育保守区，与拟南芥核不育蛋白Ms2和水稻假定雄性不育蛋白同源性分别为88 ％和98％。与拟南芥雄性不育蛋白Ms2相同．推测的雄性不育保守区也含有一 育花药中表达，而在败育花药、叶片和根中不表达，说明该雄性不育同源基因扈 于花药发育特异基因，为太谷核小育基固ms2的一个下游基因。本研究表明基 于同源序列的定位候选克隆策略与电子克降技术相结合可人大加快摹因克隆的 速度。 本研究首先试图寻找与太谷核不育基因紧密连锁的分子标记．以矮败小麦的 高杆可育及矮卡下不育DNA为亲本，分别筛选了已定位在小麦4D染色体上的11 对SSR引物和4个RFLP探针，另外还筛选了人麦、节节麦上的4个RFLP探针， 结果这n对SSR日l物和8个RFLP探针在可育及不育小麦DNA问均无差异， 分别选取小麦4D染色体短臂上两个顶端区域内的4条EST序列设计4对PCR 引物，在矮败小麦可育及不育基因组DNA中进行扩增，结果4对来自EST序列 的PCR}J物在矮致小麦中有较强的扩增带，但在可育及不育材料闻均不表现多 念。 根据比较基因组的共线性原理，推断水稻第三染色体长臀上ms7-bct区域与 ，j、麦4D染色体短臂上的ms2。Rhtl0嚣域具订可能的共线性。其中水稻BAC克 隆AC087797台有的赤霉酸反应迟钝肇因OsGAI与小麦4DSr的矮丰下基因RhtlO 高度同源，利用该BAC克隆中的22个假定基因设计22对PCK引物，在矮败小 麦可育及不育基园组DNA中进行扩增，有扩增产物的16对引物在可育与不育 基阔组DNA间扩增条带均无差异。用可育及不育花药eDNA为探针与水稻22 钝基因OsGAl在小麦花药中表达，推断小麦矮打基因RhtIO在小麦花药中也表 达。 在已有的SSR引物中，本研究束发现有与太谷核不商基因ms2连锁的标记， 为了寻找与ms2紧密连锁的SSR标职，本研究在从EST中开发新的SSR引物方 面进行了尝试。小麦EST数量的迅速增加为丌发新的SSR标记提供了宝费的数 4 1％。其中台二二核营酸重复学元期 索刘4-44条台有SSR的EST序列，捡出率7-J 三核苷酸重复单元的SSR．ESTs分别为34条(77％)和347条(78％)。利用这 35对cSSR；|物。在矮败小麦近等基因系的高杆 些小受SSR．ESTs序列建设计l 可育株和矮杆不育株莲融组DNA蚓进{亍筛选，其中82对cSSR}l物在小麦上有 扩增产物，占所设计引物总数的61％，但这82对引物在两个亲本问均不表现差 异。利用小麦一套缺体．四体系列，32对cSSR引物分别被定位到小麦除2D、4B 和4D外的18条染色体上，丰富了SSR引物隶源。 为探讨太签核不育小麦败育机制，本文利用eDNA”AFLP技术，以太谷核不 育小麦减数分裂开始前的可育株及不育株花药mRNA为材利，对太谷核不育小 麦败育发生过程中基因的差异表达进行了分析。鳓果表明t在花药减数分裂开始 前．可育花药与不肯花药中基因的表达存在很大差异。在所统计的144对引物组 台扩增结