马铃薯y病毒c基因片段dsrna原核表达及其诱导抗性.pdfVIP

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2016-02-23 发布于贵州
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马铃薯y病毒c基因片段dsrna原核表达及其诱导抗性.pdf

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马铃薯y病毒c基因片段dsrna原核表达及其诱导抗性

I删嬲目录摘要…………………………………．……………………………………………………………………………………………………I 英文摘要………………………………………………………………………………………………。Ⅱ 第一章前言………………………………………………………………………………………………1 1．1植物病毒病及其防治……………………………………………．……．1 1．2转录后基因沉默………………………………………………………2 1．2．1转录后基因沉默的发现………………………………………………．2 1．2．2转录后基因沉默的诱导………………………………………………．2 1．2．2．1转基因诱导的PTGS………………………………………………．．2 1．2．2．2病毒诱导的PTGS…………………………………………………．3 1．2．2．3 1．2．3转录后基因沉默的机制………：………………………………………4 1．2．3．1 RNA阈值模型……………………………………………………．4 1．2．3．2异常P,NA模型……………………………………………………5 1．2．3．3双链RNA模型……………………………………………………6 1．3利用dsRNA防治植物病毒病的研究进展……………………………………．8 1．3．1转基因植物中转基因转录产生的病原dsRNA分子抗病毒………………………9 1．3．2非转基因植物中体外转录出的病原dsRNA分子抗病毒………………………．10 1．3．3非转基因植物中体外表达的病原dsRNA分子抗病毒…………………………11 1．4本研究的目的与意义…………………………………………………．12 第二章马铃薯Y病毒cP基因片段反向重复原核表达载体的构建……………………．13 2．1材料……………………………………．．…………………一……13 2．1．1病毒毒源………………………………………………………．．13 2．1．2菌株、质粒和主要试剂………………………………………………13 2．2方法………………………………………………………………13 2．2．1目的片段的获得…………………………………………………．．13 2．2．1．1引物设计…………………………………………．……………13 2．2．1．2引物的稀释……………………………………………………．14 2．2．2烟草叶片总RNA的提取(酸性酚法)……………………………………14 2．2．3cDNA的合成………………………………………………………15 2．2．4本研究PCR反应体系及反应条件………………………………………．15 2．2．5目的DNA片段的回收………………………………………………．16 2．2．5．1电泳胶回收(冻溶法)……………………………………………．16 2．2．5．2乙醇沉淀回收…………………………………………………．．16 2．2．6质粒DNA的提取…………………………………………………．16 2．2．6．1质粒DNA的少量提取………………………………………………16 2．2．6．2质粒DNA的大量提取………………………………………………17 2．2．7 DNA浓度的测定……………………………………………………．18 2．2．8目的DNA的酶切…………………………………………………．．18 2．2．8．1 2．2．8．2质粒DNA的酶切………………………………………………．．18 2．2．10感受态细胞的制备…………………………………………………．19 2．2．11质粒DNA向大肠杆菌中的转化………………………………………．．20 2．2．12重组质粒的鉴定……………………………………………………20 2．2．12．1 2．2．12．2PCR鉴定………………………………………………………20 2．2．12．3少量提取重组质粒DNA的酶切鉴定…………………………………．21 2．2．12．4大量提取重组质粒DNA的酶切鉴定…………………………………．22 2．3结果与分析………………………………………………………．22 2．3．1．IRNA提取………………………………………………………．．23 2．3．1．2 RT—PCR………………………………………………………．．23 2．3．2．1目的基因片段的获得和酶切…………………