共生菌群在熊蜂生长发育过程中的动态变化.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(10):2030-2037 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.10.017 共生菌群在熊蜂生长发育过程中的动态变化 徐龙龙，吴 杰，郭 军，李继莲 （中国农业科学院蜜蜂研究所农业部授粉昆虫重点实验室，北京100093） 摘要：【目的】了解人工饲养的兰州熊蜂（Bombus lantschouensis ）肠道内共生菌群的组成，探明主要肠道 共生菌群在熊蜂生长发育过程中的变化规律，为进一步开展熊蜂共生菌功能的研究奠定基础。【方法】以兰州熊蜂 肠道总DNA 为模板，使用细菌通用的774F 和1391R 引物进行PCR 扩增，构建细菌16S rDNA 文库，挑取单克隆菌 落测序，测得序列去除chimera 后，以序列相似性97%为标准，划分分类操作单元（operational taxonomic units， OTU ），采用BLASTn 进行序列同源性分析，确定细菌种类，分析熊蜂肠道菌群的组成。根据克隆文库测得的 Gilliamella apicola 和Snodgrassella alvi 细菌16S rDNA 序列设计特异性引物。用G. apicola 和S. alvi 的 特异性引物进行PCR 扩增，构建重组子质粒，构建好的质粒经浓度测定后，10 倍梯度稀释成5 个浓度梯度，进行 荧光定量PCR 检测，绘制标准曲线。以兰州熊蜂的卵、幼虫、蛹以及0、5、10、15、20 日龄的工蜂肠道DNA 为模 板，采用熊蜂β-actin 为内参基因，对样品中的共生菌G. apicola 和S. alvi 进行荧光定量PCR 分析，并比较 不同日龄、不同虫态每微升肠道基因组DNA 样品中检测到的细菌16S rDNA 基因的拷贝数，分析共生菌数量在熊蜂 生长发育过程中的变化。不同日龄、不同虫态之间相对表达量的显著性差异用软件SPSS19.0 的单因素ANOVA 方差 分析进行统计。【结果】从文库中随机挑选213 个单克隆进行测序，经过Chimeras 分析后，共得到202 个有效序 列，这些序列共划分为16 个OTU。测得的序列与登录的相应细菌16S rDNA 序列的相似性在 93%—99%。在克隆文 库测得的细菌16S rDNA 序列中，G. apicola 占45%、S. alvi 占30%、Bifidobacterium 占10%、Fructobacillus fructose 占5%、Lactobacillus 占2%、Flavobacterium aciduliphilum 占2%，其他细菌占6%。其中G. apicola 和S. alvi 为兰州熊蜂肠道内的主要共生菌，qPCR 结果表明两种共生菌在不同日龄、不同虫态的熊蜂肠道内都能 检测到，两种细菌的数量在熊蜂发育过程中的变化趋势相似，即先增加后减少，最后达到稳定状态。G. apicola 和S. alvi 在熊蜂的卵、幼虫和蛹中数量都较少，在 5 日龄时的数量达到峰值，显著高于其他日龄，之后又逐渐 减少，在15 日龄后趋于稳定，第15、20 日龄之间差异不显著。【结论】人工饲养的兰州熊蜂肠道中主要有4 个种 属的常见共生菌：G. apicola、S. alvi、F. fructosus 和Bifidobacterium，其中G. apicola 和S. alvi 是其 体内的优势菌。G. apicola 和S. alvi 在熊蜂中都具有水平和垂直传播的特性，两种共生菌在熊蜂的卵、幼虫和 蛹中都检测到，但数量较少，工蜂出房后细菌大量增殖并在出房15 d 左右形成稳定的共生菌群。熊蜂生长发育过 程中体内共生菌数量的变化可能与这两种细菌对熊蜂的作用有关。 关键词：熊蜂；共生菌；肠道微生物；荧光定量PCR Dynamic Variation of Symbionts in Bumblebees During Hosts Growth and Development XU Long-long, WU