农杆菌介导的柳枝稷遗传转化体系的优化.pdfVIP

中国农业科学 2016,49(1):80-89 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.01.007 农杆菌介导的柳枝稷遗传转化体系的优化 1 1 1 1,2 刘燕蓉 ，岑慧芳 ，严建萍 ，张万军 1 2 （中国农业大学动物科技学院草业科学系/草业科学北京市重点实验室，北京 100193 ； 国家能源非粮生物质原料研发中心，北京 100193 ） 摘要：【目的】为建立农杆菌介导的柳枝稷高效再生及遗传转化体系。【方法】试验以柳枝稷品种 Alamo、 Performer 及 Blackwell 的成熟种子为外植体诱导愈伤组织。愈伤诱导 6 周后，借助解剖镜观察愈伤形态，去除 愈伤组织外层含水量大、海绵状愈伤组织，挑选位于愈伤组织中心位置的核状、紧实型愈伤置于继代培养基培养。 暗培养3周后，在解剖镜下挑选结构松脆、生长旺盛的愈伤组织按细胞系继代增殖培养。该类愈伤组织易于分化， 属单子叶植物愈伤组织分类中的第Ⅱ型。经两次继代增殖培养后，可以获得足够的愈伤组织进行再生和遗传转化 研究。为优化柳枝稷Ⅱ型愈伤组织的农杆菌侵染流程，试验比较了 3 种农杆菌侵染流程下的转基因效率。真空和 干燥处理（VD）：将装有愈伤组织及菌液的50 mL离心管置于真空泵中抽真空10 min（压力-0.8 MPa），28℃, 80 r/min慢摇20 min后弃菌液，将愈伤组织堆放于3层滤纸上干燥处理2 h，随后将愈伤组织转入含有500 μL无菌 水的 2 层滤纸上进行共培养；冷处理加真空和干燥处理（CVD）：侵染前将愈伤组织置于 3%麦芽糖、300 μmol·L-1 谷氨酰胺（Gln）溶液中冰浴 20 min，然后依 VD 流程侵染，共培养阶段用 MP 培养基代替无菌水；渗透冷处理加 真空和干燥处理（PVD）：用6%的麦芽糖溶液替代CVD中3%麦芽糖溶液。通过比较Gus 染色及PCR阳性率来评价三 种方法的转化效率。【结果】愈伤挑选方法不仅从柳枝稷低地型品种中挑选得到再生率达95%以上的Ⅱ型愈伤细胞 系，也首次获得高地型品种 Blackwell 的Ⅱ型愈伤组织，分化率达 50%。不同转化方法评价过程中发现，低地型 品种AlamoⅡ型愈伤组织采用CVD农杆菌侵染流程转化效率最高，达72%，显著高于侵染流程VD（53%）和PVD（44%）。 应用CVD转化法，Performer 转化率达96%；首次成功进行了高地型品种Blackwell的遗传转化，转化效率为5.6%。 【结论】本研究建立了借助解剖镜挑选柳枝稷易于再生的Ⅱ型愈伤组织的方法，该方法适用于柳枝稷不同生态型 品种；农杆菌转化过程中采用 CVD 侵染流程可显著提高转基因效率。本研究首次报道了柳枝稷Ⅱ型愈伤组织的挑 选流程，建立了适合不同生态型柳枝稷的高效再生及遗传转化体系，首次获得高地型品种 Blackwell 的转基因植 株，为柳枝稷遗传改良及其功能基因研究奠定基础。该方法也适用与其他难于再生的单子叶植物再生及遗传转化 体系的建立。 关键词：柳枝稷；高地型品种；Ⅱ型愈伤组织；遗传转化；农业杆菌介导 Optimizing of Agrobacterium-Mediated Transformation of Switchgrass Cultivars 1 1 1 1,2 LIU Yan-rong , CEN Hui-fang , YAN Jian-ping , ZHANG Wan-jun 1 ( Dep