b-cll独特抗原id-hsp70复合物及其修饰的dc体外诱导ctl抗瘤作用研究.pdf

王志华 华中科技大学同弁医学院硕士学位论支 B—CLL独特型抗原ld-Hsp70复合物及其修饰的 DC体外诱导CTL抗瘤作用研究 研究生：王志华 指导教师：沈关心教授 摘 要 目的 制备慢性B淋巴细胞性白血病(B．CLL)的独特型抗原 Td—HSP70复合物，研究该复合物及其修饰树突状细胞(Dc)的体外诱导 特异性CTL的抗瘤作用，并初步探讨其机制。 方法IPTG和乳糖诱导E．coli XL．1．blue(含质粒pMSH70)表达人 ELISA鉴定后，在一定条件下与纯化的B．CLL独特型抗原(Id—ScFv) 作用及活化的PBMC对不同肿瘤细胞的杀伤作用，ELISA试剂盒测其 上清中IL一12和TNF—a水平，FCM分析T淋巴细胞亚群变化；采用细 胞培养与分离技术，GM—CSF和IL．4联合诱导人外周血单核细胞，获 取大量的DC并经HSP70一Id修饰后，倒置相差显微镜观察其形态特征 及FCM检测修饰前后DC的表型变化；并测其分泌的IL一12和TNF一Ⅱ 情况，MTT法检测修饰的DC对自身淋巴细胞的激活和增殖作用；收 集上述刺激传代培养7d的淋巴细胞，FCM分析T淋巴细胞亚群的变化， MTT测其对Daudi、K562、HepG2等细胞的杀伤作用。 结果①经SDS—PAGE分析纯化后表达产物的分子量大约70KD， 与人HSP70蛋白的理论预期值相符，纯度达90％。@PBMC的增殖作 用、培养上清中IL．12和TNF．0【水平，复合物组均明显高于Id．ScFv组 王志华 华中科技大学同弁医学院硕士学位论支 细胞的杀伤作用较K562、HepG一2强；③FCM显示经复合物激活的 PBMC中CD8+T、CD4+T均有增加，分别为51．62％；fH 63．35％；④8d 后DC体外诱导培养成功，HSP70一Id复合物可使DC成熟，镜下可见呈 典型的DC形态，其CDla表达率为20％～30％、CD83表达率大于72％、 TNF—a办显著高于对照组(P0．01)；⑤修饰后的DC能激活自身淋巴 细胞，其刺激后传代培养的淋巴细胞具有特异性细胞毒作用：对Daudi 显作用；⑥DC刺激的淋巴细胞亚群中CD4+T和CD8+T细胞比例均显 著增加，分别为56．5l％和70．21％；⑦DC提呈抗原肽激活淋巴细胞的 途径能够有效降低HSP70一肿瘤抗原肽复合物使用剂量约50倍。 结论体外制备的Id．Hsp70复合物可增强人PBMC的特异性杀瘤 作用，其机制可能与促进PBMC细胞的增殖和分泌Thl型细胞因子， 及诱导CD8+T产生特异性细胞毒作用有关；经HSP70一肿瘤抗原肽复合 物修饰的DC，生物学活性增强，并可诱导高效而特异性的抗肿瘤免疫 效应，其机制可能为CD4_T、CD8+T及DC协同作用的结果。而且这 种直接由DC提呈抗原肽激活淋巴细胞的途径效率更高，特异性更强。 通过以上研究发现，复合物(Id．HSP70)和修饰的DC均能诱导 CTL特异性抗瘤作用，为二者体内实验和临床应用研究奠定了良好的 基础。 关键词Id．ItSP70复合物树突状细胞抗瘤效应 王志阜 华中科技大学同济医学院硕士学往论文 on Anti-tumorEffectofCTLInduced Study HSP70一Id by or DC／nvitro Complex Complex—modified Abstract the