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CDR3导向抗体库技术人源化抗膀胱癌单抗BD 博士生 周丽君 导师 王琰 摘 要 本课题在“抗原定向选择法”人源化鼠单抗的基础上探讨了一种新的人源化 技术路线——CDR3导向抗体库技术，对抗膀胱癌单抗BDI进行人源化。 首先通过RT-PCR方法从分泌抗膀胱癌单抗的杂交瘤细胞BDI中扩增鼠k链、 Fd段基因，DNA序列测定表明分别属于船EIV和MH3D亚群。将k链和Fd段基因 克隆到噬菌体表达载体p3MH中，在大肠杆菌中获得表达。通过PCR介导的定点 突变，将Fd段N端的氨基酸序列矫正为亲本鼠的原始序列，提高Fab的结合活性。 运用ELISA、竞争抑制实验、免疫组化实验证实所获Fab为BD]的Fab。 然后根据鼠单抗序列合成含鼠CDR3区的寡核苷酸引物，通过重叠PCR及DNA 重组技术，将抗膀胱癌鼠单抗BDI的CDR3区与人淋巴细胞来源的多样化的vH和 VL组合，构建含BDI 定位重组系统，经过在cre+8S1365细菌胞内的定位重组后，增加轻重链的组合配 对，最终获得容量为1×10…大容量次级噬菌体抗体库。用膀胱癌细胞(EJ)进行 四轮的吸附一洗脱一扩增，挑选第四轮筛选后的46个克隆进行ELISA检测，获得4 个能够与EJ细胞特异结合的克隆。竞争抑制实验显示，其中3个与亲本鼠单抗识 别相同的抗原表位。测定其可变区基因的序列，VH分别属vHI、VHH亚群，Vk 属VkI、VkⅥ亚群。选择活性较高的克隆进行膀胱癌组织的免疫组化实验，显示 该克隆能够与癌组织特异性结合。 本研究通过鼠CDR3对人抗体库的限定，使所获抗体库具有预定的偏向·陛，有 利于特定抗体的筛选。同时将loxp—cre重组系统引入噬菌体抗体库中，构建大容 量抗体库。不用鼠单抗做模板进行链替换，获得了与鼠单抗识别相同表位的人源 抗体。 关键词噬菌体抗体库；鼠单抗人源化；ioxD—crff重组系统；膀胱癌． Humanization of mouse anti—’bladder cancer McAbCDR3 by directed phage antibody library Ph。D．Candidate： Zhou Lijun Tutor： gan Wang Abstract onthebasiS of selection．weanewmousemAb guided epitope explored humanizationmethodCDR3 directed phageantibody library． K an