hcgβ-ct多聚体-3c3d融合蛋白在巴氏毕赤酵母中的表达及产物纯化.pdfVIP

中义摘要 中文摘要 chorionic 人绒毛膜促性腺激素(human 层合体细胞合成和分泌的一种糖蛋白激素，在早期妊娠中起促进胚泡发育、维持 妊娠的作用。因此，hCG疫苗最初作为一种理想的避孕疫苗而受到人们的重视。 近年来的研究表明，绝大多数恶性肿瘤细胞能表达hCG类分子，并随着肿瘤细 胞的进一步增殖扩散，其hcG的表达量会不断增加，在肿瘤细胞发生转移时其 表达量达到最高值。研究表明，hCG在细胞转化、肿瘤血管生成、肿瘤转移和 免疫逃逸中起重要作用。因此，hCG疫苗还可以用于恶性肿瘤的治疗。 为糖蛋白激素家族，具有相同的(21亚基，其13亚基也与LH的B亚基有部分同源 性，只有hCG 分子所特有的，并含有hCG的特异表位，其诱导产生的抗体具有更好的抗原特 异性。其不足之处是CTP的分子量小，抗原性较差，产生的抗体中和hCG生物 活性的能力低。我们曾通过基因重组的方法在毕赤酵母和大肠杆菌中成功地表达 了CTP二聚体、三聚体、四聚体，并制备了相应的多克隆抗体，证明了hCGB —CTP37多聚体产生的抗体滴度高于单体产生的抗体滴度。 为了进一步提高hCG且-CTP37疫苗的免疫原性并减少疫苗的制备工艺，我 们利用基因工程的方法在重组的hCGB．CTP37多聚体的基因上连接了分子佐剂 得 到 表 达 质 和 体pPIC9K 及读码框正确后，电转入酵母细胞GSll5。利用不同浓度的G418对转化子进行 筛选，以得到含高拷贝目的基因的克隆。克隆经PCR鉴定后在甲醇诱导下进行 表达。Western blot分析结果表明成功表达了融合蛋白hCGB．(CTP)3、 kD、 40kD、125 kD和138kD左右。实际分子量与理论分子量相符。 蛋白纯化一直是蛋白表达领域的难点问题。我们对表达产物进行了一系列纯 化方法的探索，并初步确立了有效的纯化步骤。我们依次使用了盐析、凝胶过滤 和离子交换的方法对表达的融合蛋白进行了纯化，获得了初步纯化产品。为进一 步研究其免疫原性和用作抗肿瘤疫苗奠定了基础。 关键词：hCGB．CTP多聚体；C3d；毕赤酵母；盐析；亲和层析；离子交换 凝胶过滤 Abstract Abstrael Humanchorionic aheterodimeric hormone gonadotropin(hCG)isglycoprotein andsecreted acentralroleinthe bysyncytial plays produced trophoblast，which of first vaccineswere as establishment the pregnancy．Ininstance，hCG developed that vaccinetoelicitanti-hCG would contraceptive antibody disruptpregnancy． studieshave thathCG-likemoleculeswere Recently,manysuggested expressedby