脑脊液双向凝胶泳方法的建立及帕金森病脑脊液蛋白质组学的初步研究.pdf

旃脊液双向凝胶电泳方法的建市及帕金森病脑脊液虽白质组学的初步研究 脑脊液双向凝胶电泳方法的建立及帕金森病 脑脊液蛋白质组学的初步研究 硕士研究生：李焕敏 导 师：邵明主任医师 中文摘要 帕金森病(ParkinsonDisease，PD)是一种以中脑黑质多巴胺神经元变性、缺失， 以静止性震颤、运动迟缓、肌强直、姿势步态异常为主要特征的神经系统变性疾病。 目前认为可能由多种基因突变、环境毒素、年龄老化共同作用的结果ul。但引起PD 的确切病因和发病机理迄今仍不清楚。随着蛋白质组学的发展，有关神经系统的脑 脊液蛋白质组学也渐渐展开，但帕金森病脑脊液研究较少，而且脑脊液为高盐低蛋白 体液，其中高丰度蛋白(自蛋白，lgG等)占据绝大部分，使具有重要生理作用的低丰度 蛋白检出下降，分辨率低。如何改善脑脊液样品处理，提高分辨率和重复性，建立稳 定的脑脊液双向凝胶电泳技术足尚待解决的问题。 polyacrylamidegel 脊液2-DE图谱，寻找有意义的差异蛋白。为脑脊液蛋白质组学提供技术平台，并 为探索帕金森病发病机制提供新的思路。 方法；1．建立稳定的脑脊液双向凝胶电泳体系①用OasisHLB柱层析分馏将脑 脊液中高丰度蛋白去除，过滤液冻干，丙酮沉淀去盐浓缩，提取脑脊液中低丰度蛋 Gradientlsoelectic 白。②以固相pn梯度等电聚焦(ImmobilizedpH Focusing， dodecyl IPG．mF)为第一向，垂直平板十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium sulfate polyacrylamidegel 染法对电泳后的凝胶染色，采集凝胶图像并进行图像分析。2．根据己建立的实验方 法进行帕金森患者脑脊液蛋白质组学研究，寻找差异点，并行质谱鉴定。 2D图像分析软件对脑脊液处理进行了分析显示：仅用 结果：①用lmageMaster HLB柱处理去除高 丙酮沉淀处理脑脊液的2-DE图谱蛋白质点为264个，通过Oasis 脑脊液双向凝胶电泳方法的建屯及帕金森病脑脊液蛋白质组学的初步研究 丰度蛋白质的2-DE图谱蛋白质点为441个。相同区域内低丰度蛋白质分辨率明显增 加，点数明显增多59．86％。②对三张脑脊液蛋白质pH4．7范围的2-DE图谱进行重 复性分析显示：三张图谱检测到的蛋白质点数分别为458、491、485个点，两两匹 配率平均为80％，重复性良好；③脑脊液2．DE图谱蛋白点分布特点：极酸性蛋白 和极碱性蛋白较少，大多数蛋白质为中性蛋白或偏酸性蛋白，等电点分布在pH4～7 聚集了大量蛋白质；④获得了PD患者和对照组脑脊液2-DE图谱。比较两组2．DE 图谱显示在PD患者脑脊液中5个蛋白点含量明显减少，有1个蛋白点含量明显上 结论： 1、运用OasisHLB过滤柱层析分馏可以有效地去除脑脊液中高丰度蛋白质，使低 丰度蛋白检出率增加，建立了稳定的脑脊液双向凝胶电泳体系； 2、PD患者与对照组脑脊液蛋白质表达有明显差异，部分蛋白质在PD患者脑 脊液中上调或下调，这些差异蛋白质可能与帕金森病发病机制有关。 关键词：帕金森病、脑脊液、双向凝胶电泳、质谱 2 脑脊液双向凝胶屯泳方法的建立及帕金森病脯脊液蛋白质组学的移j步研究 of fluidand Establishmentof2-DE primary eerebrosp