体外诱导人脐带充质干细胞分化为胰岛样细胞研究.pdf

目 录 中文摘要……………………………………………一 英文摘要……………………………………………一 研究论文体外诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛 —^L—jL· 日U吾一一一一一…一一一……-一一…-…-……一…一一--…-…- 材料与方法………………………………………………………一8 3 结果………………………………………………………………-l 6 附图………………………………………………………………一l 附表……………～………………………………………………一25 讨论…．…．………．．……．……．…．…．………-．一一……一一一………一27 结七仑一．……～……．．…．…………．．…．．………………-一……一…-30 参考文献…………………………………………………………一30 综述 干细胞治疗糖尿病的研究进展…………………………………一33 致谢．．……．…．………………．……．…一………一……一………………一一46 个人简历………………………………………………………………一47 ● l ●L11j 1 stem 岛细 向胰 胰岛 方法： 1无菌条件下取足月剖宫产胎儿脐带(获得家属知情同意)，自两根 脐动脉间沿血管长轴剪开脐带被膜，去掉血管，采用组织块贴壁培养法从 人脐带Wharton’s Jelly中分离培养MSCs，倒置显微镜下观察其形态变化； 抗体、CD44抗体及CDl05抗体的表达； 2采用胶原酶原位灌注消化法和滤网过滤法分离大鼠胰岛细胞，特异 性的双硫腙(Dithizon，DTZ)染色进行鉴定； 倒置显微镜下观察细胞贴壁后，将分离获得的大鼠胰岛细胞团以50个／ 进行诱导分化，倒置显微镜下观察诱导过程中hUC．MSCs的形态变化； 免疫细胞化学法鉴定诱导后hUC．MSCs的胰岛细胞早期标志即胰十二指 Duodenal 肠同源框．1基因(Pancreatic 免法定量检测单纯培养组和共培养组细胞的胰岛素及C肽分泌水平，观 察两组细胞的胰岛素分泌功能变化趋势及对葡萄糖刺激实验的反应性。 结果： 1利用组织块贴壁培养法从人脐带Wharton’S Jellyqb分离出的贴壁细 胞，倒置显微镜下观察，7天左右可见组织块周围出现贴壁生长的短棒状 或梭形样细胞，14天左右细胞形态变为均一的长梭形，20天左右达70—80％ 融合，可进行传代扩增培养，传代后细胞形态类似成纤维细胞，呈平行排 中文摘要 列生长或旋涡状生长；细胞传代培养至第3代，流式细胞学鉴定细胞表面 胞传代培养至第10代，仍然稳定保持着MSCs的特性。 灌注消化及滤网过滤分离后可获得300个左右的胰岛细胞团，DTZ染色 呈棕红色： 周边突起缩短，形态逐渐变为椭圆形，诱导至第7天时，可见散在的半悬 浮生长的胰岛样细胞团，双硫腙染色呈棕红色，诱导至第lO天左右．胰 岛样细胞团体积变小，形态变得松散不规则，诱导至第14天时，胰岛样 程中形态无明显变化，仍呈长梭形生长； 4共培养组诱导至第3天和第7天时，胰岛样细胞经免疫细胞化学染 的胰岛样细胞，PDX．1阳性细胞罕见。单纯培养组PDX．1表达阴性； 5采用放免法在共培养组的培养上清中检测到较高水平的胰岛素及 C肽分泌，单纯培养组检测到少量的胰岛素，几乎检测不到C肽。经 SPSSl3．0统计软件分析，共培养组与单纯培养组相比，细胞培养上清中 胰岛素分泌水平在不同的培养时间均有统计学差异(pO．01)。共培养组： 第3天和第14天的细胞培养上清中胰岛素的分泌量无明显统计学差异 细胞培养上清中胰岛素的分泌水