含htrailluc基因的腺病毒双表达载体的构建.pdf

中文 摘 要 含h下RA比及LUC基因的腺病毒双表达载体的构建 摘 要 目的:构建含人肿瘤坏死因子相关调亡诱导配体 (humanTNF-RelatedApoptosisInducingLigand,hTRAIL)和 萤火虫荧光素酶 (fireflyluciferase,LUC)的腺病毒载体， 为用影像学方法在活体_E间接监测治疗基因hTRAIL的表达 奠定基础。 方法:用BgI11和Xbal酶切质粒PDC-LUC后，回收 1700bp大小LUC的DNA片段;用Baml-II和Xbal酶切含 内核糖体进入位点(interairibosoeentrysite,IRES)基因的质 粒Pclon5后，回收其线性化片段。用T4DNA连接酶连接上 述两片段，LUC基因就插入到Pclon5的IRES基因的下游， 命名为Pclon5-LUCoPclon5-LUC用KpnI和XbaI酶切鉴定。 将Pclon5-LUC用BgI11和Xbal酶切，回收IRES-LUC 基因，与用BamHI/Spel酶切后线性化的Pclon9连接，获得 含多克隆位点的Pclon9.5-LUC，先用EcoRI与AgeI酶切鉴 定，再用ScaI酶切鉴定。 Pclon9.5-LUC用EcoRI和XhoI酶切，回收含多克隆位 点IRES-LUC基因片段。PDC312-CMV用EcoRI和SalI酶 切，回收线性化片段，将含多克隆位点的IRES-LUC基因片 段插入到 PDC312-CMV 中两个绝缘子 中间，即 PDC312-CMV-9.5-LUC，用PstI酶切鉴定。 将PDC312-CMV-9.5-LUC用EcoRI和Sall酶切，回收 线性化片段;PDC-humanTRAIL用EcoRI和Salt酶切，回 中文 摘 要 收hTRAIL基因片段，并插入到PDC312-CMV9.5-LUC中， 命名为PDC312-CMVL-TR.PDC312-CMVL-TR先用EcoR I与SalI酶切鉴定，判断hTRAIL基因是否插入到质粒中; 用BamHI与KpnI酶切鉴定，判断切下的片段是否与载体 上的酶切位点一致;再用PCR方法分别扩增hTRAIL及LUC 基因。 将质粒PDC312-CMVL-TR与含有5型腺病毒右臂的质 粒pPE3(包含除了5型腺病毒188-1339bp以外的整个5型 腺病毒基因)通过Lipofectamine2000共转染293细胞。共转 染后9-14天出现病毒空斑，收获出现细胞病变的293细胞， DNA-QIAampBloodMimiKit试剂盒抽提病毒DNA,PCR 筛选重组克隆。经过三次病毒空斑纯化，提取腺病毒载体 AD-SG-hTRAIL-LUC(即含hTRAIL及LUC的腺病毒双表 达载体)的DNA，用PCR进行鉴定。重组腺病毒载体感染 293细胞进行病毒扩增，经过四次扩增，纯化后，用50%组 织培养感染剂量法测定病毒滴度。 结果:对腺病毒载体构建过程中侮个步骤构建的质粒进 行鉴定的结果如下: 质粒Pclon5-LUC用KpnI与XbaI酶切鉴定，琼脂糖凝 胶电泳可见1072bp,1834bp,3127by的条带。理论上 Pclon5-LUC上有两个KpnI酶切位点，分别的位于658bp与 1730bp，有一个XbaI酶切位点位于3564bp，三个酶切位点 相互之间的DNA片段大小分别1072by,1834bp,3127bp, 与酶切后的片段大小一致，说明质粒Pclon5-LUC构建成功。 质粒Pclon9.5-LUC首先用AgeI与EcoRI酶切鉴定，琼 脂糖凝胶电泳可见2324bp,3259by的条带，理论上，从Age z 中文 摘 要 I到EcoRI的片段大小为2324bp和3259by，与电泳结果相 符;Scal酶切鉴定，0J一见3169bp,2414bp的两个条带，连 接产物上有两个SeaI酶切位点，两者之间的片段大小为3169 by和2414bp，与电泳结果相符，质粒Pclon9.5-LUC构建成 功。 质粒PDC312-CMV-9.5-LUC用PstI酶切