重组表达载体pelect-gfpzeo-rhbmp2转染兔骨髓充质干细胞生物学特性研究.pdfVIP

目 1录 ···-···················································-········································1 ……………………………………………………………………………………3 充质干细胞生物学特性研究 前言…………………j……………………………………………………………………7日IJ舌………………………………………………………………………………………’’7 材料与方法……………………………………………………………“8 结果………………………………………………………………………………………·25 附图…………………………………………．．．…………………………………………28 附表………………………………………………………………………………………·36 讨论………………………………………………………………………………………·38 结论………………………………………………………………………………………·42 参考文献……………………………………………………………一42 综述骨髓间充质干细胞在医学领域中的研究………………………一45 致谢………………………………………………………………………………………………55 个人简历……………………………………………………………………一56 MP2转染兔骨髓间充 究 marrow 干细胞(bone stem mesenchymal 的绿色荧光蛋白真核表达载体，将其转染兔BMSCs，通过筛选获得高效 表达BMP．2的兔BMSCs，为后期骨组织工程动物试验奠定基础。 方法：1选择健康新西兰白兔，冬眠灵0．5ml肌肉注射麻醉，于胫骨 免疫细胞化学法对培养的兔BMSCs进行表型鉴定。 DH5仪，PCR、酶切鉴定并测序。 3按照LipofectmineaM2000Reagent说明书，分别用上述空环状质粒 表达载体和重组表达载体转染兔BMSCs，有限稀释法筛选阳性表达兔 BMSCs。 法和WesternBlot法鉴定兔BMSCs中rhBMP2重组蛋白表达。 壁生长，呈长梭形、三角形或多角形，并有多个突起，存活率达90％以上， 经多次传代仍能保持正常形态和功能；传代培养的兔BMSCs潜伏期为 增殖减慢；冻存复苏后细胞生长特性无明显改变；免疫细胞化学染色结果 显示，CD44阳性表达率达95％，呈棕褐色，细胞表型稳定。 1 6bp 中文摘要 法将重组表达载体转染兔BMSCs细胞48～72h后，荧光显微镜下观察证实 转染成功，经RT-PCR证实目的基因在转染载体中表达。采用免疫荧光化 Blot方法检测到目的基因的蛋白表达。重组真核表达载 学方法和Western 体pSELECT-GFP 7kD。 rhBMP2，rhBMP2分子量约1 结论：l在本培养体系下，可以得到纯化的兔骨髓间充质干细胞，所 培养的兔BMSCs贴壁率高、体外生长状况良好、增殖能力强并可连续传 代，适用于组织工程种子细胞库的建立。 2本研究成功构建了含有增强型绿色荧光蛋白的BMP2真核表达载 的绿色荧光标记，给rhBMP2的体内外示踪定位提供了重要而方便的工具， 为下一步开展动物实验提供了实验基础，并为组织工程临床应用提供了物