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人合子重构与卵子激活的初步研究 中山大学硕士论文刘颖 人合子重构与卵子激活的初步研究 硕士研究生 刘颖 指导老师 周灿权 教授 中山大学附属第一医院妇产科生殖中心 510080 中文摘要 作为生物学发展史上最伟大的成就之一，核移植技术是发育生物学基础研究 的有力工具，在研究配子和胚胎发生、基因表达调控和核质互作等方面作用重要。 核移植与人类生殖研究领域密切相关。 治疗性克隆即利用体细胞核移植得到的人囊胚建立病人个体化的人Es细胞 系，是体细胞核移植技术与干细胞技术的结合，是治疗一些退行性疾病的新希望， 也是当今生命科学最热门的领域之一。 此外，随着妇女年龄的增长，女性卵子质量明显地降低。卵浆质量下降的原 因之一可能是抗凋亡因子和促凋亡因子失衡，线粒体膜电势缺陷。人们推测补充 健康供卵卵浆可望复原受体卵浆质量。通过细针注射胞浆移植治疗，可在非常低 妊娠率的人群中获得大于50％的妊娠率，但其作用机制、有效性和可能存在的 危险却仍缺乏深入研究。采用显微操作技术将合子原核从老龄妇女受精卵中分离 出来并与已去除原核的年轻妇女受精卵卵浆进行融合的原核移植是最为彻底的 核一质置换方式，可避免细针注射胞浆技术存在的各种问题。通过该技术，可利 用辅助生育治疗中废弃的胚胎构建成核一质异质重构胚，并结合干细胞技术得到 相应的胚胎干细胞。当它们应用于单纯的科学研究，是研究核一质关系的良好模 型。 细胞核移植的效率与重构卵的电融合以及激活的效率紧密相关。 提高融合率，是提高核移植效率的主要途径之一。电融合的原理是依据细胞 膜的液态性，在短时程的高电脉冲作用下引起膜的流动状态，使2个相互接触的 细胞膜融合在一起。电融合效率受到融合液组成(主要是受渗透压)、脉冲性质 人台子重构与卵子激活的初步研究 中th大学硕士论文刘颖 (强度、数量和持续时间)的影响。 在精子或某些理化因素的刺激下，卵母细胞恢复并完成减数分裂，这一过程 称为卵母细胞激活。利用理化因素的卵子激活即卵母细胞的人工激活，卵子人工 激活得到的胚胎是人工孤雌生殖的产物。不同激活方法的激活机理基本是一致 的，最终目的均是要将停止在MII阶段的卵母细胞恢复分裂周期，这就必须使胞 内的MPF和CSF的活性降低或消失。激活途径有两种，一是钙离子信号通路，钙 离子载体和电刺激等是通过激发单脉冲性钙离子升高而实现的。二是Mos／MAPK 通路，蛋白质合成抑制剂、蛋白磷酸化抑制剂等通过调节蛋白激酶或蛋白磷酸酶 活性，降调MPF、CSF而诱导卵母细胞激活。 人类体细胞核移植技术效率的提高对治疗性克隆的发展有巨大的促进作用， 然而目前人体细胞核移植的效率非常低，成为治疗性克隆发展的瓶颈，受体卵母 细胞未被充分激活可能是症结之一。受到伦理道德的约束，且人源性配子非常珍 贵，来源非常有限，都制约了人类核移植技术的发展。另一方面，虽然绵羊、牛、 小鼠等哺乳动物体细胞核移植的成功为人的研究提供了可贵的参考，但它们与人 的机制与构造毕竟有物种差异，而目前关于人类体细胞核移植的研究尚无确实报 道，因此进一步摸索人类体细胞核移植，特别是电融合／电激活的操作细节和实 验条件非常重要。 本研究通过摸索不同阶段卵予的电融合／电激活方法，对人合子重构与卵子 激活进行了的初步探讨，建立了利用多原核受精卵通过原核移植构建核一质异质 胚的方法，优化了人卵母细胞孤雌激活的方案。 第一部分：人原核期合子重构的初步研究 【研究目的】 利用人多原核受精卵为材料，摸索人类配子进行电融合／电激活操作的具体 技术细节，从电融合条件的优化着眼探索人原核移植技术和构建核一质异构胚胎 模型的方法，为研究人类核质问相互关系以及探讨胞浆移植技术的机制提供实验 依据和物质基础。 【材料和方法】 (一)材料 ．n． 人合子重构与卵子激活的初步研究 中山大学硕