动脉粥样硬化兔管平滑肌钙激活钾通道活性变化和一氧化氮对其的直接激活作用.pdf

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动脉粥样硬化兔管平滑肌钙激活钾通道活性变化和一氧化氮对其的直接激活作用

动脉粥样硬化兔血管平滑肌钙激活钾通道活性变化和一氧 化氮对其的直接激活作用 摘要 smoothmuscle 平滑肌细胞(vascular cells,VSMC)大电导的钙激 活钾通道(Bl(ca)活性是否发生变化,并探讨这种变化的病理生理意 (nitricoxide,NO)供体,研究No是否可以直接激活VSMCBk以及 AS时血管平滑肌细胞B艮对N0的反应性是否发生改变,以进一步探 讨N0的扩血管机制,同时探索AS时更为有效地扩张血管的新途径。 方法:1.AS模型的建立:选用3月龄新西兰兔20只,雌雄不限, 随机分成实验组和对照组,每组10只。实验组喂高脂饲料(含0.5% 胆固醇+5%猪油+15%蛋黄粉+79.5%普通饲料),3周后减去饲料中的胆 固醇,再喂5周以建立AS模型,对照组只喂普通饲料8周;2.AS模 型的鉴定:喂养8周的兔模型经麻醉和抗凝处理后开胸,取胸主动脉 并纵向剖开,肉眼直接观察AS形成情况,,以半定量法判断每只兔主 动脉损伤程度分值并结合光镜和电镜检查兔胸主动脉AS病变特点, 对建立的AS模型进行鉴定;3.急性酶分离获取单个主动脉平滑肌细 胞:将胸主动脉模型小条置于细胞分离酶液瓶中,进行37。C恒温水 浴振荡20~30分钟,使细胞间质及周围的连接组织尽量被酶消化, 然后将被充分消化后的主动脉组织放于盛有溶液2的小玻璃瓶中,以 溶液2洗涤两次,再用尖端光滑的吸管轻轻吹打,以使单个平滑肌细 胞尽可能游离于溶液2中,然后用吸管吸出滴于铺在玻璃培养皿中的 小载玻片上,放于4C冰箱中静置2~4小时备用;4.单通道膜片钳 玻璃微管电极拉制:将特制的毛细玻璃管固定予PP-83微电极拉制器 上,拉制成尖端内径约1uⅢ,充灌电极液后其阻抗约5~8MQ的微 电极;5.高阻封接的形成:将分离所得的平滑肌细胞放于盛有浴液2 m1的浴槽内,在倒置相差显微镜下选择符合要求的单个平滑肌细胞 进行实验。将充灌好电极液的微电极固定于电极探头上,用注射器向 微电极内略施加正压(1~2cmH。0),操作三维操纵器将电极送入浴液, 然后由电子刺激器经膜片钳放大器向微电极发放电压为lmV,波宽 为40ms的方波脉冲信号,经三维操纵器将微电极缓慢地向已选择好 的细胞表面推进,估计将接触细胞膜表面时,调节放大器上“V-COPM” 旋扭,将电极电压补偿到O。同时换用高倍物镜,用三维操纵器微调 让微电极尖端轻轻接触细胞膜表面,见应答电流立即变小时,撤去正 ClllH。O),应答电流 压,通过注射器向电极腔内略施加负压(10~30 逐渐下降到O,电流噪声随之减小,刺激方波消失,完成高阻封接 (gigaohm patches)和内面向外式膜片(inside—outpatches)两种方式来记 录B艮单通道活性。当电极尖端与细胞膜表面形成高阻封按时,即通 过改变钳制膜电压,观察并记录通道开放活性的电压依赖性。然后通 过三维操纵器迅速将电极提出液面,在空气中暴露2~3秒钟后,迅 速放回浴液中,再通过改变钳制膜电压,观察并记录在此构型下通道 开放的电压依赖性。最后加入不同浓度的CaClz溶液并记录通道开放 m1 对Ca“敏感性。记录完毕用浴液对浴槽进行灌洗,在浴槽内盛2 ul,5×10“MISMN 浴液,然后依次向浴槽内加入2×10。6MISMN溶液10 u1,5×lO。5M ul、20 溶液36 ISMN溶液16 ul,浴液中ISMN的浓度 对BI(c。的作用。结果:1.实验组新西兰兔胸主动脉内膜肉眼可见明显 的大小不等的斑点、条纹和斑块;光镜下可见实验组主动脉内膜灶性 增厚,病灶表层由大量胶原纤维、平滑肌细胞(SMC)、弹性纤维及蛋 白聚糖形成纤维帽,纤维帽下放可见不等量的泡沫细胞、SMC、细胞 外脂质及炎细胞;电镜下可见增生的平滑肌细胞内有许多空泡。与对 cell—attached patches(膜电位

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