半巢式聚合酶链应快速诊断真菌性角膜炎.pdf

半巢式聚合酶链反应快速诊断真菌性角膜炎 硕士研究生：刘丽梅 指导教师：孙洪臣 教授 专业名称：眼科学 摘 要 真菌性角膜炎是主要的致盲性眼病，尤其在发展中国家。在中国， 过去十年里真菌性角膜炎的发病率上升明显。早期精确的诊断并给予 合理的治疗是决定真菌性角膜炎预后的关键。目前，真菌性角膜炎的 确诊依然依靠临床表现和传统实验室技术。但是这些常用实验室诊断 方法(涂片镜检和真菌培养)存在很多局限性，例如灵敏性和特异性 较差，易受主观因素和药物治疗的影响，为此，需要建立快速、特异、 chain reaction，PCR)。 有效的诊断技术，例如聚合酶链反应(polymerase 众所周知，应用真菌特异性引物配合PCR扩增技术诊断真菌性角膜炎 比传统的实验室检查技术更加灵敏、快速、特异，但还没广泛应用于 临床。扩增目的序列的选择是决定PCR特异性的关键，真菌核糖体 RNA(rRNA)基因是公认的多拷贝高保守基因，存在于所有的真菌中， spacer PCR)包括两轮扩增过程，因此可以提高PCR技术的灵敏性和特异性， 区来检测疑诊真菌性角膜炎患者角膜刮片中的真菌DNA；2比较半巢 式PCR技术、涂片镜检和真菌培养诊断真菌性角膜炎的阳性率；3评 价半巢式PCR技术用于真菌性角膜炎临床诊断的可行性。 菌株和20例(20眼)临床疑诊真菌性角膜炎患者角膜刮片中的真菌 DNA。结果与涂片镜检和真菌培养的诊断阳性率相比较。另外，在第 PCR，MPCR)技术同 一轮扩增中，采用多重聚合酶链反应(Multiplex 时检测标本中的真菌和细菌DNA，以确定是否合并细菌感染。 结果：应用半巢式PCR技术所有标准真菌和20例临床疑诊真菌 性角膜炎的角膜刮片中真菌检测均呈阳性，但是标准细菌和正常人角 膜组织真菌检测均阴性，扩增片段长约290bp，半巢式PCR扩增共耗 时5小时。而在第一轮扩增中，应用MPCR技术所有标准真菌和仅13 例临床标本真菌检测阳性，真菌扩增片段长约550bp；所有标准细菌细 菌检测阳性，但所有临床标本细菌检测均为阴性，细菌扩增片段长约 996bp。第一轮MPCR的真菌诊断阳性率为65％，与涂片镜检阳性率 显差异。半巢式PCR的真菌检测阳性率为100％，明显高于涂片镜检 MPCR和半巢式PCR的检测灵敏度分别为5个和1个茄病镰刀菌孢子。 结论：半巢式PCR技术的灵敏性和特异性明显高于单一的PCR技 特异、可靠的诊断真菌性角膜炎的实验窒方法，具有良好的临床应用 前景。 关键词：半巢式聚合酶链反应 真菌性角膜炎 诊断 of keratitis Rapid seminested diagnosis fungal using chainreaction polymerase Limei Postgraduate：LIU Sun Supervisor：ProfessorHongchen Speciality：Ophthalmology Abstract keratitisisaworldwide Fungal