急性中枢神经系感染性疾病中病原体抗原联合检测方法的研究——急性细菌性脑膜炎中常见病原菌抗原检测方法（免疫斑点法）的建立.pdfVIP

中文 摘 妥 急性中枢神经系统感染性疾病中 病原体抗原联合检测方法的研究 一急性细菌性脑膜炎中 常见病原菌抗原检测方法 (免疫斑点法)的趁立 摘 要 目的:建立用免疫斑点法 (Dot工mmunobinding assay,Dot-Iba)检测急性细菌性脑膜炎中结核杆菌、脑膜 炎双球菌 ((A群)、肺炎球菌抗原三联诊断方法 方法:1健立用免疫斑点法检测已知的结核杆菌 (卡介 苗)抗原 将试验用卡介苗超声波裂解 (超声 30秒，间隔 30秒，如此反复)，低温离心 ((20000rpm)取上清液，定量 蛋白浓度((1.34mg/ml)，用二倍顺序稀释法，稀释至1:800- 1:204800等不同浓度 ;兔抗结核杆菌 PPD多克隆抗体 (4mg/ml)稀释至1:200一1:6400;通用型抗VR/兔酶标抗体 稀释至 1:10-1:40。用方阵滴定法确定所有试验点及其相应 的抗原抗体反应浓度。每个试验点重复6次，以出现肉眼能 判读的棕色斑点或圆圈者为阳性，不能判读者为}矜哇，且每 次试验均设阴性对照。对每个阳性反应点用 “MoticMed6.0 数码医学图像分析系统 ((A)”读取光密度值 (OD值)，求出 每个试验点的平均OD值，分析数据、选择检测结核杆菌抗 原的最佳兔抗结核杆菌PPD多克隆抗体滴度和酶标抗体滴度 的反应组合。两种抗体滴度固定后，进一步检测不同稀释度 中丈摘 要 的抗原，读取数据，分析 OD值变化与抗原含量的关系，绘 制标准曲线，求出回归方程及相关系数。 2.建立用免疫斑点法检测己知的脑膜炎球菌 (A群)伉原 将脑膜炎球菌 ((A群)超声波裂解，低温离心 (20000rpm) 取上清液，定量蛋白浓度 (0.23mg/ml)，用二倍顺序稀释法， 稀释至 1:100-1:25600等不同浓度;鼠抗A群脑膜炎球菌 单克隆抗体 (0.lmg/ml)稀释至1:20-1:640;通用型抗鼠/ 兔酶标抗体稀释至1:10-1:40。用方阵滴定法确定所有试验 点及其相应的抗原抗体反应浓度。每个试验点重复6次，以 出现肉眼能判读的棕色斑点或圆圈者为阳性，不能判读者为 阴性，且每次试验均设阴性对照。数值的读取及抗体反应滴 度确定，标准曲线的绘制等同卡介苗抗原的检测。 3.建立用免疫斑点法检测己知的肺炎球菌抗原 将肺炎 球菌超声波裂解，低温离心 (20000rpm)取上清液，定量蛋 白浓度 ((1.37mg/ml)，用二倍顺序稀释法，稀释至 1:400^ 1:102400等不同浓度;鼠抗肺炎球菌单克隆抗体(0.5mg/ml) 稀释至 1:100一1:3200;通用型抗鼠/兔酶标抗体稀释至 1:10^1:40，余下步骤方法同卡介苗抗原和脑膜炎球菌抗原 的检测。 4.将结核杆菌 (卡介苗)抗原、脑膜炎球菌抗原、肺炎 球菌抗原点样在一张硝酸纤维素膜上的不同区域，同时设置 阴性对照，用选定的抗一结核杆菌、抗一脑膜炎球菌、抗一肺 炎球菌抗体浓度和酶标抗体浓度分别对其进行检测，建立结 核杆菌、脑膜炎双球菌 ((A群)、肺炎球菌三联诊断方法。 结果:1.在结核杆菌抗原检测中，确定兔抗结核杆菌 PPD多克隆抗体浓度 1:200(Mig/ml)，通用型酶标抗体浓 中文摘 要 度 1:10为最佳反应浓度组合;进一步稀释抗原建立标准曲 线，求出回归方程Y=0.2663X-0.0252，相关系数r=0.9823, 经统计学检验 P0.05。同时设置的对照血清均为阴性，无 非特异性反应发生;最小结核杆菌 (卡介苗)抗原检出量为 3.65ng/ml。 2.在脑膜炎球菌抗原的检测中，确定鼠抗 A群脑膜炎球 菌单克隆抗体浓度 1:160(0.625wg/ml)，通用型酶标抗体浓 度 1:10为最佳反应浓度组合;进一步稀释抗原建立标准曲 线，回归方程Y=0.0532X-0.0106，相关系数r=0.9349，为 显著相关，经统计学检验P0.05。设置的对照血清均为阴性， 无非特异性反应;最小脑膜炎球菌抗原检出量为36ng/mlo