抑制人类宫颈癌胞hpv16 e6e7基因活性的sirna表达载体的构建.pdf

Y909016 摘要 抑制人类宫颈癌细胞中HPVl6E6，E7基因活性的si瑚叮A表达载体的构建 (国家自然科学基金课题 摘要 目的构建能抑制HPvl6E6／E7基因活性的稳定表达siRNA的重组载体。为进一 步研究其干扰系统对HPVl6E6／E7基因活性的抑制作用打下基础，也给我们以后研究 HPVl6 E6／E7基因的功能以及宫颈癌的基因治疗提供了新的技术和方法。 siRNAdes 方法①应用美国Oligoengine公司的targetigntools设计软件设 计并化学合成各60个碱基的编码短发夹RNA序列的、分别靶向HPvl6E6，E7基因的 寡核苷酸正反义链。②将寡核苷酸正反义单链进行退火形成双链。③BglII、HindⅢ双 酶切处理psuPER．Retro逆转录病毒载体。④将酶切后的载体和退火后的双链寡核苷 酸进行体外连接构建重组载体，同时设立阴性对照。⑤采用1×TsS两步法将重组载体 转化感受态细胞JMl09，筛选阳性转化子，用碱裂解法提取。⑥用EcoRI—HindIⅡ双酶 star 切鉴定阳性克隆，同时以空质粒做阴性对照。⑦PcR鉴定阳性克隆，引物应用DNA 设计软件设计。⑧测序鉴定阳性克隆。 结果 ①Bgl E6 和pSUPER．Retro一16E7载体经EcoR ③DNAstar设计软件设计引物，重组载体用PcR方法扩增产物长度是384bp，而阴性 对照的空质粒扩增产物的长度为1207bp。④插入基因片断序列的测序分析，结果表明 60个碱基成功插入到预计的位点，并且序列完全一致。 结论抑制人类宫颈癌细胞中HPVl6E6／E7基因活性的siRNA表达载体构建成 功。 硕士研究生：杨玲(妇产科学) 导 师：王言奎主任医师 罗兵 教 授 关键词宫颈癌；人乳头瘤病毒；E6基因；E7基因：RNA干扰；小 干扰RNA；质粒psuPER；逆转录病毒载体； ABSTRACT ConstructionofsiRNA vector systerⅢof expressing HPVl6 E6／E7activity inhibiting Abstract 1’oconslructrecombinantVecIorofsiRNAinorderlojnhibjt 0bjectiVe cxpressing HPVl6E6／E7 willbeusefulfbrIhe ofHPVl6E6／E7 avtiv“ity．Which study activily ccrvicalcanccL jnhibitionandof传r meansf