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生物技术第三章 PCR技术 3.1 PCR原理 3.2 定量PCR PCR原理 PCR反应 变性 复性 延伸 PCR反应包括三个步骤 双链DNA在高温下形成单链(变性); 低温下引物与单链DNA互补配对(退火); 在适宜温度下Taq DNA聚合酶催化引物沿模板延伸。 重复3个基本步骤，可以在数小时内使特异DNA片扩增数百万 倍。 标准PCR反应体系 引物 引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。 引物的重要性 引物设计原则 1. 碱基分布的均衡性 同一碱基连续出现不应超过5个； GC含量一般40-60%，GC含量太低导致引物Tm值较低，太少扩增效果不佳，也易于引发非特异扩增。 5. 引物中有或能加上合适的酶切位点 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析 或分子克隆很有好处。 6.引物长度： 一般通过引物长度和退火温度控制特异性。如果PCR 的退火温度设置在近于引物Tm值(引物/模板双链的解链温 度)的范围内，20个碱基左右的Oligo，应具备很好的序列 特异性。 7.保守性 通用引物——扩增同一类分子 8. 引物的特异性 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性； 用Blastn软件进行同源性比较, 尽可能选择与非目的基 因同源性小的序列作为引物, 选择3’端与非目的基因 不同源的序列作为引物 引物的量 每条引物的浓度0.1 ~ 1umol或10 ~ 100 pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好；引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会 引物完整性：避免反复冻融 引物Tm值 一般要求：55℃-65℃。 计算： 对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算 对于 14 ~70 个核苷酸的引物可用以下公式计算。?Tm=81.5+16.6（1g[K+]）+0.41（G+C）%-（675/N） ?N 表示引物的核苷酸数目， [K+] 表示单价离子即钾离子 的浓度。 退火温度: 一般采用较引物Tm值低5℃作为PCR退火温度 引物设计软件 Primer Premier 5.0 Oligo primer 3 The Primer Generator NetPrimer Oligonucleotide selection Program； Desiger PCR 引物同源性分析 用Blastn软件进行同源性比较 尽可能选择与非目的基因同源性小的序列作为引物 选择3’端与非目的基因不同源的序列作为引物 DNA聚合酶 Taq酶 黄石国家森林公园火山温泉中嗜热水生菌YT-1菌株中分离（ Thermus aquaticus ）， 生长环境70℃-75℃； 具有5`→3`DNA聚合酶活性，缺少3`→5`的外切酶活性（因商品酶而异），出现错配的机率2.1x10-4 ； Taq酶在70-75℃活性最高，92.5 ℃ 、95 ℃ 、97.5 ℃环境中酶的生物活性半衰期分别为130分钟、40分钟、5-6分钟。 Tth DNA 聚合酶来自嗜热热细菌（Thermus thermophilus）HB8 ，由 Promega 公司开发成商品。 94kDa ，在 74℃ 进行扩增，在 95℃ 的半衰期为 20 分钟。 在 Mg2+ 存在下，条件下以 DNA 为模板合成 DNA ； 而在 MnCl2 存在下可以 RNA 为模板合成 cDNA 。可在高温下做 RT-PCR 、反转录和引物延伸反应， 避免 RNA 反转录过程中形成的二级结构。 Vent DNA 聚合酶火山口分离的嗜热球菌 （Thermococcus litoralis ）中分离的，具有 3-5 外切活性的高温 DNA 聚合酶，由 New England Blabs 公司开发出商品。酶分子为 85kDa ，具有更长的半衰期，在 100℃（使用 MgSO4）时，其半衰期为 1.8 小时。 ?Pwo DNA 聚合酶 Pwo DNA 聚合酶来自 Pyrococcus woesei（BM），大小为 90kDa ，由原德国宝灵曼公司开发。在 100℃ 的半衰期大于 2 小时，出错率低。具有 3-5 外切活性的且具有高保真度的 PCR 酶。 Pfu DNA 聚合酶 来自激烈热球菌（Pyrococcus fariosus），具有理想的扩增保真度，具有极高的热稳定性，是目前使用最广泛的具有 3-5 外切活性的 PCR 酶。 商用混合酶为了提高扩增的保真度或扩增较长的 DNA 片段，将 Taq DNA 聚合酶的强启动能力和具有 3