小麦过敏原α-溶蛋白编码基因的分子克隆的研究.pdf

摘要 摘要 小麦被联合国粮食及农业组织(FAO，1995)认定为八大类食物过敏原之一， 小麦过敏是一个不可忽视的食品安全问题，它多见于迟发性过敏反应，有较高 的病患率和漏诊率，且并发症状比较多，严重影响着过敏患者的生活。随着我 国加入WTO和国际上对食品安全要求的不断提高，在国际贸易中涉及的小麦过 敏问题将给我国的面制品的生产发展带来严重的挑战。因此，在我国开展小麦 过敏的研究具有重要的价值。 小麦醇溶蛋白(gliadin)是乳糜泻的主要致病抗原，醇溶蛋白以多肽单链的 形式存在，富含谷胺酰胺和脯氨酸，有a、13、丫、03四个片段，这些蛋白的毒性 已被肯定，对粘膜损害较大，其中以0【片段为最甚。尽管提取小麦醇溶蛋白并不 困难，但要从大量高度同源的这类蛋白混合物中提纯某种单个的蛋白却并非易 事，而通过体外大量表达则可以解决这个问题。 本研究的主要内容包括小麦过敏原a．gliadin基因的克隆及序列分析、 工作如下： l以小麦品种(郑麦9023)为实验对象，成功地提取了基因组DNA。通过 TA克隆构建了克隆载体pMDl9．T．c【．gli，通过抗性及蓝白斑筛选，获得了阳性 克隆子。阳性克隆子经过原位PCR、酶切及测序鉴定，结果表明含目的基因， 证明载体构建正确。克隆出的目的基因的同源性检索分析表明，成功地克隆到 正确的仅．gliadin基因序列。 (DE3)pLysS中，PCR扩增和酶切分析显示构建正确。测序结果，表明插入片 段大小、序列、位置、方向均正确。采用IPTG进行诱导，通过SDS．PAGE电泳 检测，获得大小约为57kD的表达蛋白带，与理论估计值相符。采用1．0mmol／L 左右。 3采用生物信息软件和互联网服务器，预测了Q．gliadin的二级结构和 tt-gliadin表面特性(亲水性、柔韧性、表面可及性和抗原性指数)。结果显示， n 摘要 0【．91iadin属于一种结构混合型蛋白，含有Ot．螺旋、p．片层、p．转角和无规则卷曲 四种结构。经过亲水性方案、柔韧性方案、表面可及性方案、抗原性指数评估 以及二级结构预测等综合考虑，a—gliadin的B细胞表位的区段可能位于8~21， 含有p一转角或无规则卷曲结构。 关键词：a．醇溶蛋白；小麦过敏；基因表达：表位预测 II! ABSTRACT ABSTRACT Wheatwasdefinedasoneofthe foodstheFoodand eight by majorallergenic to in1995．Wheatisconsideredbeaseriousfood AgricultureOrganization allergy toa were issues，which delayedanaphylaxis．Theremajorprevalence safety belongs rateandrateofmissed toadeteriorationinthe oflifefor diagnosis，leading quality wheat sufferers．WithChinas into forfood allergy entry WTO，demandsafety increases