泛素行异性蛋白USP26突变型去泛素化酶活性检测.pdfVIP

目 录 中文摘要……………………………………………………………………．1 英文摘要……………………………………………………………………．4 研究论文泛素特异性蛋白酶USP26突变型去泛素化酶活性检测 前言……………………………………………………………………．8月U吾……………………………………………………………………．8 材料与方法……………………………………………………………．8 结果…………………………………………………………………．．16 附图…………………………………………………………………．．19 讨论…………………………………………………………………．．24 结论…………………………………………………………………．．25 参考文献……………………………………………………………．．25 综述泛素特异性蛋白酶USP26的研究进展…………………………．．29 致谢………………………………………………………………………．．37 个人简历…………………………………………………………………．38 中文摘要 泛素特异性蛋白酶USP26突变型去泛素化酶活性检测 摘 要 目的：泛素特异性蛋白酶(ubiquitinspecific 于X染色体q26．2区域，基因编码区由一个外显子构成，含2794个碱基， 编码913个氨基酸，推测其蛋白质分子量约104KDa。班p2继因属于去泛 素化酶家族(deubiquitinating 酶体途径发挥多个作用，包括多聚泛素链的分离，将被泛素化的蛋白上 的泛素去除以避免蛋白被降解，以及去除泛素残基促进蛋白酶体的降解 作用和泛素的再利用，进而调节蛋白的活性或其降解。Usp26自flwang等 首次报道，分离自小鼠精原细胞。在人和小鼠中，usp26在睾丸组织特异 性表达。但是目前对于卿2继因的生理机制和分子途径并不十分清楚。 AM 最近有一些研究指出，usp26基因多态性可能与男性不育相关。Dirac 等的研究提示USP26在雄激素受体信号传导途径中的作用可能与其去泛 素化酶活性有关。因此，我们通过检钡)Jusp26)L种突变型的去泛素酶活性 变化，研究usp26基因的几种突变型对其去泛素化活性的影响，为usp26 的分子途径和生理功能提供线索，同时为研究usp26基因与男性不育症的 关联性研究奠定基础。 方法： M．G．Dirac 1质粒的构建。野生型usp26基因由荷兰研究者Annette 位点，以便后续构建质粒。引物序列：上游引物为5’．QQ缱￡￡ ATGGCTGCCCTATTCCTAC．3’， 下 游 引 物 为 5’一鱼鱼△!gg 行测序鉴定。 中文摘要 GT、1274 2定点突变。利用定点突变的方法构建5个SNP：468 AT、2204TG、2239 1 CT、2144 AT突变型及CS无活性突变型91 GC。分别以特异性引物进行定点突变PCR反应，反应条件95℃预变性 30sec，95℃变性30sec，55℃复性1min，68℃延伸10min，18次循 rain。 环，最后72℃延伸5 入BL21细菌中，IPTG诱导蛋白表达。细菌超市破碎后，将底物 Resin纯化后，1O％SDSPAGE电泳 GST融合蛋白用GSH．Sepharose 小鼠荧光抗体进行蛋白质印迹分析。采用Odyssey双色红外激光成像系 统进行结果收集。 结果： 1定点突变：对测序结果进行序列分析证实定点突变