泛素特异性蛋白USP26分子克隆及活性检测.pdf

JIIIIIIIl UlflJUIIIll lJllIIII110 目 录 中文摘要…………………………………………………………………．．I 英文摘要……………………………………………………………………4 研究论文泛素特异性蛋白酶USP26分子克隆及活性检测 前言……………………………………………………………………．8日U舌……………………………………………………………………．为 材料与方法……………………………………………………………9 结果…………………………………………………………………．．22}口木…………………………………………………………………--二二 附图…………………………………………………………………．27 讨论…………………………………………………………………．．43 结论…………………………………………………………………．．45 参考文献……………………………………………………………．．45 综述泛素特异性蛋白酶USP26与男性不育…………………………50 致谢……………………………………………………………………．．58 个人简历………………………………………………………………．．59 中文摘要 泛素特异性蛋白酶USP26分子克隆及 活性检测 摘 要 目的：泛素．蛋白酶体途径通过蛋白质的泛素化修饰，即泛素与靶蛋 白氨基酸残基的结合来参与调节细胞细胞周期，膜蛋白转运，转录调 控，组蛋白功能，免疫应答以及DNA复制和修复等多种重要进程。它 对维持细胞正常的生命活动是非常重要的。然而这种蛋白修饰又是一种 泛素化与去泛素化可逆、动态的过程。去泛素化酶通过负向调节蛋白的 泛素化，在泛素介导的细胞过程中发挥重要作用。去泛素化酶(DUBs) 功能失调可导致多种疾病，包括遗传性肿瘤和神经退行性疾病等。 去泛素化酶(DUBs)多属于半胱氨酸水解酶，又可分为四个亚型： 家族中的一种。 员之一。有关USP26基因多态性与男性不育的关系还仅仅限于人群基因 分型研究，但是受到人种、地域以及样本量等因素的影响，这些SNP是 否与男性不育相关联还不是很清楚。本研究通过克隆人的USP26基因， 酶活性检测体系，分析这些SNP是否对去泛素化酶活性产生影响，从而 验证USP26基因是否引起男性不育，为后续的进一步研究提供理论支 撑。 方法： 液中提取正常人基因组DNA，采用分段扩增的方法，运用聚合酶链式反 usp26-3’分别克隆至rJpGEM．Teasy载体上，采用蓝白斑筛选实验确定阳性 中文摘要 克隆并通过碱裂解法提取质粒，经双酶切鉴定正确后再测序分析。将测 序正确的pGEM．T-usp26-5 为媒介，最终得到重组质粒pGEX．6p—1．usp26。 的重组质粒以及C304S突变型质粒。然后通过限制性内切酶更换载体 准备。 (4)构建两种去泛素化酶活性检测体系，检测人野生型USP26、6 Resin纯化蛋白系统纯化 Ub52作为模型底物。经过GSH—Sepharose—TM GST融合蛋白，然后进行1 切断生成36kDa蛋白产物，即为去泛素化酶活性阳性，否则为阴性，而 性，两者比例判断活性大小。 结果： (1)从人血液中克隆出泛素特异性蛋白酶USP26编码基因，全长 2742bp。 (2)构建出USP26 6种SNP重组质粒pGEX—usp26-G170R、pGEX- 中文摘要 1 usp26一E 经酶切鉴定及测序验证均正确。 (3)表达出分子量约为130 kDa)牙DGST(分子量为26kDa)的理论分子量相符， (分子量约为104 并且在15℃、37℃