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第5章 分子生物学研究法(上)——DNA、RNA及蛋白质操作技术 教学目的： 1. 熟悉DNA基本操作技术的原理及操作步骤。 2. 熟悉RNA基本操作技术的原理及操作步骤。 3. 熟悉基因克隆技术的原理及操作步骤。 4. 了解蛋白质与蛋白质组学技术的原理。 教学重点： DNA和RNA的基本操作技术。 第5章 分子生物学研究法(上)——DNA、RNA及蛋白质操作技术 5.1 重组DNA技术史话 5.2 DNA基本操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 基因克隆技术 5.5 蛋白质与蛋白质组学技术 从20世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。 基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和PCR扩增等，是分子生物学研究的核心技术。 基因工程是指在体外将核酸分子插入载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。 基因工程技术是核酸操作技术的一部分，强调外源核酸在另一种寄主细胞中的繁衍与性状表达。 5.1 重组DNA技术史话 分子生物学研究的起步主要表现在3个方面： 在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题。 在20世纪50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和世代交替问题。 在20世纪50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。 但当时缺乏有效的分离和富集单一DNA分子的技术，而无法对这类物质进行直接的生化分析。 随着DNA分子体外切割与连接及核苷酸序列分析技术的进步，推动了重组DNA技术的产生与发展。 重组DNA的核心是用限制性内切核酸酶和DNA连接酶对DNA分子进行体外切割与连接。 工具酶的发现与应用是现代生物工程技术发展史上的重要事件(见P167表5-1)。 将外源DNA和载体分子重组成杂种DNA分子后，还必须通过转化过程将其导入到新寄主细胞中，才能保证重组DNA分子的增殖。 5.2 DNA基本操作技术 自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。 核酸凝胶电泳是现在通用的分子生物学研究方法。是DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础。 凝胶的分辨率与凝胶的类型和浓度有关(P174表5-2)。 在凝胶电泳中，一般要加入溴化乙锭(EB)染色。EB染色后的核酸分子在紫外光下发出荧光。 核酸凝胶电泳的基本原理： 某种分子在特定的电场中，就会以一定的速度向适当的电极移动。 某物质在电场作用下的迁移速度称为迁移率。 迁移率与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比(分子大小、极性、介质的粘度系数等)。 生理条件下，核酸分子中的糖-磷酸骨架中的磷酸基团呈离子化状态。把核酸分子放置在电场当中，将会向电场的正极方向迁移。 普通凝胶电泳只能进行DNA小片段分离，应用脉冲电场凝胶技术可进行超大DNA片段的分离研究。 5.2.2 细菌转化 细菌转化是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。 提供转化DNA的菌株叫作供体菌株，接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。 处于能够接受外源DNA状态的细胞称为感受态细胞。 细菌转化常用的方法：CaCl2法和电击法。 CaCl2法：将快速生长中的大肠杆菌置于经低温(0℃)预处理的低渗氯化钙溶液中，造成细胞膨胀，膜通透性改变。 电击法：锐利的电脉冲可在细胞膜上造成小凹陷，再形成孔洞。 5.2.3 聚合酶链式反应技术 聚合酶链式反应(PCR)是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。 PCR体系的基本组成： 超纯水、缓冲液、Mg2+、dNTP、DNA模板、引物、TaqDNA聚合酶。 PCR的主要步骤(3步多次循环)： 变性(90℃~96℃) 在加热或碱性条件下可使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，称之为变性。 退火(25℃~65℃) 是模板与引物的复性。引物是与模板某区序列互补的一小段DNA片段。 延伸(70℃~75℃) 结合在特定DNA模板上的引物为出发点，将四种脱氧核苷酸以碱基配对形式按5?→3?的方向沿着模板顺序合成新的DNA链。 5.2.4 实时定量PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信