4人工染色体载体解析.pptVIP

λ-噬菌体载体和M13-噬菌体载体的装载量最大分别为25 kb和1.5kb，装载量无法满足现代基因工程的需要。 在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度，就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体DNA与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒。 由于cos质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。 能像l-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞； 能像质粒那样在受体细胞中自主复制； 重组操作简便，筛选容易； 装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围； 不能体内包装，不裂解受体细胞。 ②大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子。 结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出30～45kb的外源DNA插入载体DNA，此时，每个载体只可能插入一个外源片段，因为如果二个片段，则将超过包装成噬菌体颗粒的限度； ③细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一DNA片段的菌落很费时间。 　 现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯质粒制成的基因文库常常不太稳定，插入的大片段外源DNA有可能通过同宿主基因组交换而致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千 kb 的DNA片段。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。 细菌人造染色体（BAC） 酵母人造染色体（YAC） 用于酵母菌转化子筛选的标记基因主要有营养缺陷型互补基因和显性基因两大类 营养缺陷型互补基因 主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因， 如：LEU、TRP、HIS、LYS、URA、ADE 但对于多倍体酵母来说，筛选营养缺陷型的受体非常困难 显性标记基因 显性标记基因的编码产物只要是毒性物质的抗性蛋白 主要结构： ①两个可在酵母菌中利用的选择基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基因)； ②酵母菌着丝粒序列 (centromere4,CEN4)； ③一个自主复制序列(ARS1)； ④两个来自嗜热四膜虫 (Tetrahymenna thermophilp)的末端重复序列(TEL)，以保持重组YAC为线状结构； ⑤在两个末端序列中间，有一段填充序列(HIS3)，以便pYAC4在细菌细胞中稳定扩增； ⑥Amp抗性及细菌质粒复制原点； ⑦一个EcoRⅠ克隆位点，该位点位于酵母菌Sup4 tRNA基因内。 Sup4基因编码赭色抑制Trp-tRNA，抑制赭色表型(成为白色)。 不含外源DNA片段的pYAC4载体转化酵母菌，转化子的菌落呈白色。 带有插入的外源DNA片段的pYAC4重组载体，其Sup4已经失活，结果转化酵母菌后所产生的转化子形成赭色菌落。 一般酵母表达载体都以大肠杆菌质粒为基本骨架再加上酵母的自主复制序列，选择标记，外源基因插入位点，启动子和终止子。 既能在酵母菌中复制也能在大肠杆菌中复制，所谓酵母菌—大肠杆菌穿梭载体。 ①启动子和终止子的选择； ②表达盒的稳定性； ③外源蛋白的累积部位； ④产量的提高。 　　不管是(a)程序还是(b)程序，最后获得的重组线形DNA分子必须保留质粒的复制起始位点(ori)和选择标记基因，保证重组的线形DNA分子导入受体细胞后，cos末端自行连接环化，按质粒的性质进行自主复制，并且有效地表达选择标记基因的产物，供筛选阳性克隆子。 五、 cosmid克隆载体（自学P72） 常用的粘性粒有PHC79、PJB8、MUA-3和KOSI等，它们大多具有一种或多种限制性内切酶的单一酶切位点。采用这种大容量载体不仅可减少构建基因组DNA文库的重组克隆数目，减少工作量，提高筛选时的阳性检出率，而且极其适合高等真核基因的克隆工作。 六、 构建cosmid文库应注意哪些问题 ①载体分子的自身连接，从而导致效率降低或者失败。 载体自身只相当于可以插入片段的1/10左右，因此往往会出现载体同载体自身连接，结果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一起。但用碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接； 　　YAC具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。此外，YAC还具有酵母菌染色体的一些特点。可以接受100-1000kb的外源DNA片段。 第二节 酵母人工染色体载体 酵母人工染色体(yeast artificial chro