腺病毒介导东亚钳蝎氯毒素抑制神经胶质瘤研究分析.docVIP

腺病毒介导东亚钳蝎氯毒素抑制神经胶质瘤的研究 【摘要】：东亚钳蝎(ButhusmartensiiKarshch,BmK)的氯离子通道毒素(BmKCT)来源于蝎尾腺的毒囊中,与以色列金蝎(Leiurusquinquestriatus)的氯离子通道毒素(Chlorotoxin,CTX)有68%的一致性并有相似的蛋白结构,均为36个氨基酸和4对二硫键组成。两种毒素具有相同的生物学功能,能特异的结合恶性神经胶质瘤细胞氯离子通道和基质金属蛋白酶2,从而抑制胶质瘤细胞的侵润生长和迁移。恶性胶质瘤由于其侵润性生长的生物学特性给目前的手术治疗带来极大的困难,不能彻底切除瘤组织导致了极强的复发性,而连续的放化疗会导致复发的胶质瘤细胞对放化疗的不敏感性,因此氯离子通道毒素能特异的结合恶性胶质瘤细胞却不结合正常胶质细胞给靶向药物的研究带来了希望。利用131I、Cy5.5以及纳米材料标记的氯离子通道毒素在胶质瘤的诊断和治疗上取得了良好的效果,但氯离子通道毒素只是由36个氨基酸构成的小肽,在体内很容易被循环清除或降解。为了使氯离子通道毒素在体内稳定高效地表达,本研究利用基因工程技术,构建了携带BmKCT基因的重组腺病毒Ad-BmKCT,分析了对体外胶质瘤细胞增殖、迁移和凋亡的影响,探讨其可能的作用机制；通过裸鼠荷瘤鼠模型检测Ad-BmKCT对神经胶质瘤的抑制效果,并利用大鼠荷瘤鼠模型评价Ad-BmKCT在体内对主要组织器官的影响及病理变化。主要结果如下：1.根据哺乳动物偏爱密码子表优化了BmKCT基因,并构建到腺病毒载体骨架质粒上,包装扩增了重组腺病毒Ad-BmKCT,检测了浓缩纯化后的病毒滴度,RT-PCR证实了Ad-BmKCT在AD293细胞扩增过程中有BmKCT的表达。2.流式细胞仪分析重组病毒感染的细胞GFP阳性率和GFP平均荧光强度,筛选了Ad-BmKCT和对照组Ad病毒对大鼠脑神经胶质瘤细胞株C6和人神经胶质瘤细胞株U251的最佳感染浓度RT-PCR分析表明BmKCT在重组病毒感染C6细胞后持续表达能力在72h内一致。通过MTT、BoydenChamber实验、划痕实验和流式分析检测了Ad-BmKCT对胶质瘤细胞的增殖、存活能力、迁移和凋亡的影响。结果显示,Ad-BmKCT可以抑制胶质瘤细胞的增殖、存活能力和迁移并能诱导胶质瘤细胞的凋亡。3.构建了大鼠脑神经胶质瘤C6细胞稳定表达红色荧光蛋白(RedFluorescenceProtein,RFP)的细胞株C6/RFP,皮下接种Balb/c裸鼠荷瘤,评价Ad-BmKCT瘤内注射在荷瘤鼠模型的治疗效果。游标卡尺测量计算肿瘤体积显示Ad-BmKCT注射组的荷瘤鼠肿瘤块增殖明显减缓；小动物活体成像仪分析RFP的表达发现Ad-BmKCT治疗组肺部转移率明显降低；治疗40天后对照组有4只荷瘤鼠死亡,Ad治疗组有2只死亡,Ad-BmKCT治疗组没有死亡出现,存活率曲线表明Ad-BmKCT组荷瘤鼠存活时间延长。4.采用免疫系统健全的大鼠皮下接种C6细胞荷瘤,通过组织切片病理学分析评价Ad-BmKCT对各主要组织器官的安全性。通过瘤内注射Ad-BmKCT病毒48h和72h分析重组病毒对大鼠各脏器的急性毒理,发现Ad-BmKCT能缓解荷瘤后脾脏组织淋巴细胞增生,在肝脏会引起炎症和少量淋巴细胞侵润但不会造成肝损伤,并且不会对肾脏、肺脏和脑组织有影响。长期毒理发现重组病毒注射后不会引起大鼠行为异常和死亡。5.通过Western-blot技术检测了细胞增殖相关蛋白C-myc、肿瘤迁移相关蛋白MMP-2、凋亡相关蛋白细胞色素C的释放和caspase家族蛋白的表达情况。结果提示Ad-BmKCT可能是通过降低C-myc、MMP-2的表达来抑制细胞的增殖和迁移,促进细胞色素C的释放并上调caspase-3蛋白的表达来诱导细胞凋亡。【关键词】：东亚钳蝎氯离子通道毒素神经胶质瘤腺病毒载体基因治疗 【学位授予单位】：山西大学 【学位级别】：博士 【学位授予年份】：2013 【分类号】：Q51 【目录】：中文摘要16-18ABSTRACT18-21第一章文献综述21-421蝎氯毒素概述21-301.1引言211.2蝎氯毒素的来源与性质21-221.2.1蝎氯毒素的来源和基本功能21-221.2.2蝎氯毒素的化学性质221.3蝎氯毒素基因组织结构和多肽序列分析22-241.3.1基因组织结构22-231.3.2多肽序列分析23-241.4蝎氯毒素的结构与功能24-251.4.1蝎氯毒素的结构特征24-251.4.2蝎氯毒素结构与功能的关系251.5氯毒素的药理学研究25-291.5.1氯毒素治疗神经胶质瘤的研究25-261.5.2氯毒素与神经胶质瘤结合位点分析26-271.5.3蝎氯毒素抑制胶质瘤侵袭和迁移的机制探讨271.5.4蝎氯