生物大分子的色谱分离技术及应用(西北大学现代分离研究所)资料.ppt

九、应用 第五节 高效体积排阻色谱High Performance Size Exclusion Chromatography (SEC) Size-exclusion chromatography Size-exclusion chromatography Absorbance at 280 is used to identify protein-containing fractions. You can also perform an enzyme specific assay. 要根据待分离物质的分子量，选择特定的凝胶过滤基质； 凝胶过滤层析不仅可用于亲水性分子的分离，也可用于疏水性分子的分离，当用于疏水性分子分离时，该类层析往往被称为“凝胶通透层析”； 凝胶过滤层析可提供样品的分子量信息； 凝胶过滤的上样量一般在柱床体积的1～5％； 凝胶过滤的样品浓度越大越好，但一般不要超过100mg/ml。 凝胶过滤的注意事项 九、应用 粗分离 除盐 测量分子量 第六节 多维色谱 (Multi-dimesional liquid chromatography, MDLC) 目标蛋白质 其它特征… 等电点 分子大小 带电状况 疏水性 目标蛋白的特征 相对分子质量 根据以上信息，首先进行第一维分离,然后将第一维馏分再进行第二维分离。 为了得到最大的分离效率,必须注意以下两点: 1. 理想情况下,各维应具有完全不同的分离机制; 2. 高维的分离速度应快于低维的分离速度,以避免已分开的组分在高维分离中重新混合。 Giddings 理论 多维色谱的总峰容量(P)等于每一维的峰容量(Pi)的乘积。 P=P1×P2×P3 ······ 假如两种分离系统都有100的峰容量,那么良好的二维系统理论上可产生10000的峰容量。 Giddings指出峰容量的提高程度和样品组分分布的有序程度有着密切的关系。 与一维分离模式相比,多维分离技术的最大特点是可极大地提高峰容量。 样品维数(sample dimen-sionality) 只有当这两个维数相等时,才能充分发挥多维系统的分离能力。 样品维数大于系统维数： →组分的峰分布是无序的,会限制分离的效果。 样品维数小于系统维数： →尽管组分的峰分布是有序的,但多维系统的高峰容量的性能并没有得到发挥。 1. 多维高效液相色谱(HPLC) 3. 多维高效液相色谱-毛细管电泳(HPLC-CE) 2. 多维毛细管电泳(CE) 常见的多维色谱分析法 多维高效液相色谱(HPLC) 即是将分离机理不同而又相互独立的两支色谱柱串联起来构成的分离系统。 样品经过第一维的色谱柱进入接口中,通过浓缩、捕集或切割后被切换进入第二维色谱柱及检测器中。 在一维分离系统中不能完全分离的组分,可能在二维系统中得到更好的分离,分离能力、分辨率得到极大的提高。 以二维液相色谱为例： * 蛋白质分离纯化技术 多维液相色谱 特异性配体 　　只针对单一的物质进行特异的结合而与其它物质不作用。 抗体－抗原，抗生素蛋白－生物素，激素－受体，蛋白－受体 　　这类配体的选择性高，使用方便，但为数较少，其特异性常随分离条件发生变化，因此，对不同的分离对象为获得特异性配体，常常需要通过大量的实验进行筛选。 通用性配体 　　通用性配体在一定条件下可与一类或几种生物分子作用，这种配体一般为小分子。具有容量高，花费低等突出优点。另外，通过改善吸附和洗脱条件，可以弥补通用性配体亲合色谱特异性较差的缺点。 　　三嗪染料，金属螯合、组氨酸、核苷酸等。 1、三嗪染料 三嗪染料是多环芳香族的硫化物，含有三嗪反应基团，与基质的连接很容易，有许多官能团可以和蛋白质进行作用，在分离时与蛋白质作用包括离子交换、疏水和电荷转移等。在一定的pH和离子强度下，染料与蛋白质表面残基上的电荷和疏水性差别等综合因素造成蛋白质对染料的选择性吸附。染料对蛋白质的作用机理还不清楚。 2、金属螯合配体 金属螯合配体是利用过渡金属如Fe2+,Ni2+,Cu2+和Zn2+等能与电子供给体N，S和O等原子以配位键连接。用亚氨二乙酸类螯合剂与重金属离子作用，生成带有多个配位基的金属螯合物。这类螯合物在水溶液中与水分子高度溶剂化，具有活泼的羟基和由盐产生的活性基团。 这些与基质连接的金属螯合物上的配价位点就是生物分子的吸附位点，这些位点在溶液中由溶剂分子或阴离子占据。因此，在制备连接基质的螯合物配体时要综合考虑两个因素。即配价金属的稳定性和金属螯合物的配价位点。 不同吸附位点的螯合物对蛋白质的选择性和容量也不相同。金属螯合物