ELISAwesternblot免疫组化RT-PCR实验方法原理及其在SCI论文材料方法结果中的写作资料讲解.pptVIP

* * * * 生物素(biotin)又称维生素H，是一种小分子维生素，分子量为244，是转氨甲酰基化过程中的辅酶。 抗生物素(avidin)，又称卵白素或亲和素，是一种分子量为67000的碱性蛋白，对生物素具有很强的亲和力，比抗原抗体间的亲和力要高出100万倍。它由4个亚基组成，每个亚基都有生物素的结合位点。 两者均可与抗体等大分子生物活性物质相偶联，又可被酶类等多种示踪物所标记，形成生物素-抗生物素系统。 * 生物素(biotin)又称维生素H，是一种小分子维生素，分子量为244，是转氨甲酰基化过程中的辅酶。 抗生物素(avidin)，又称卵白素或亲和素，是一种分子量为67000的碱性蛋白，对生物素具有很强的亲和力，比抗原抗体间的亲和力要高出100万倍。它由4个亚基组成，每个亚基都有生物素的结合位点。 两者均可与抗体等大分子生物活性物质相偶联，又可被酶类等多种示踪物所标记，形成生物素-抗生物素系统。 * * * * * * * * * * 交叉反应是指不同抗原分子上有相同或相似的抗原决定簇,一种抗体可以与两种或两种以上的抗原发生反应。 多抗是单抗的混合物，因此多抗的性质是一个群体综合的性质。 比单抗更容易捕捉抗原。因为含有抗不同表位的抗体，多种抗体都可与抗原结合。 特异性相对较差：因为由不同性质的抗体组成，只要其中含交叉反应的抗体，多抗就有交叉反应，所以多抗更容易有交叉反应。 抗体的纯化、标记比单抗难：因为含有各种不同类型、亚类的抗体，提纯、标记的方法有所差别。同时,血清中含有的杂蛋白比较多。 * HAT：次黄嘌呤（H)、胸腺嘧啶核苷（T)、氨基蝶呤（A) * 1. 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性。 2. 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性。（HRP） 3. 酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，由此进行定性或定量分析 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * ABC法 免疫组化 一抗、生物素化的二抗、ABC复合物（亲和素+酶标生物素） 产生多级放大，从而提高生物反应的敏感性和特异性。 生物素和亲和素有很强的亲和力，比抗原-抗体的亲和力要高一万倍以上。 卵白素-生物素-过氧化物酶复合物 SP三步法 免疫组化 脱蜡与水化 2.细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 抗原修复、暴露抗原决定簇 封闭非特异性蛋白 一抗孵育 生物素标记的二抗二抗孵育 SP(链霉亲和素-过氧化物酶) 反应 显色 复染、脱水、透明、封片 细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 ABC法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合。 灵敏特异性低，成本低。 结果分析 免疫组化 阳性着色细胞计数法：在40*光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组3~6张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。 Melatonin：褪黑素 Hy: hypoxia缺氧 Nestlin: 巢蛋白，特异性的表达在神经上皮干细胞 神经干细胞增殖分化 Journal of Pineal Research IF = 7.812 结果分析 免疫组化 灰密度分析法：通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域、相同条件下用Image pro plus进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。 结果分析 免疫组化 评分法：通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0~3分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（1~4分为0~25%、26~50%、51~75%、76~100%），最终可以分数相加，再进行比较。 相同曝光时间、相同显色时间 大体分为阴性、弱阳性、阳性 B D C A E F G H Ⅱ Ⅲ Ⅳ Normal 常见问题分析 免疫组化 原因? 解决办法 抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长 降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）抗体孵育时间：室温1小时或4℃过夜 孵育温度过高，孵育温度超过37℃ 一般室温20-28℃ DAB显色时间过长或DAB浓度过高 显色时间不能超过5-10分钟，以显微镜下观察为准 染色过强 常见问题分析 免疫组化 染色弱 原因 解决办法 抗体浓度过低，孵育时间过短 提高抗体浓度，孵育时间不能少于60分钟 试剂超过有效使用期 及时更换试剂 操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥） 室温太低，低于15℃ 若室温低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-