氟烷基因检测介绍.docVIP

商品猪的氟烷基因型研究 摘要：为了了解市场上商品猪猪肉的质量情况，本实验采用聚合酶链反应结合限制酶内切技术（PCR-RFLP）研究商品猪的氟烷基因型。结果表明：在我们取的7个样品猪中，有一头商品猪的DNA为杂合子，即双链DNA中有一条DNA发生了基因突变，患有猪的应激敏感综合征。 关键词：氟烷基因；PCR扩增；聚合酶链反应结合限制性内切酶技术；凝胶电泳 单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorpgism，SNP），指的是由单个核苷酸—AT，C或G的改变而引起的DNA序列的改变，(Rynodine receptor, RYR1) 基因CDS序列第1843位碱基“C”突变为“T”，使蛋白第615位精氨酸(Arg,CGC)变成了半胱氨酸(Cys, TGC)，引起蛋白结构和功能改变，这种改变能够引起猪的应激敏感综合征。猪应激综合增是指猪在应激因子（如驱赶、运输、防疫注射、配种、受惊吓等）等的应激下，发生恶性、高热综合征，表现为呼吸急促，心跳加快，肌肉僵直，后肢呈现痉挛性收缩等，甚至突然死亡。而对商品猪而言，会导致猪肉质量严重下降，如肌肉苍白质地疏松和有液体渗出×TAE溶液，均匀混合后，微波炉加热2 min，使琼脂糖充分溶解，小心取出（防止烫伤），等温度降至50-60 ℃时，加入1-2 μL的EB或者EB替代物，摇匀后轻轻倒入到专用槽中，防止气泡出现，并插上梳子，等凝胶充分凝固后，备电泳。 Ⅱ 凝胶电泳 将凝胶取出，放在水平电泳槽中，倒入1×TBE溶液，将凝胶完全浸没。然后取3 μL PCR反应产物，并与3 μL上样缓冲液混匀，将其点入梳孔中；同时在其中一梳孔中加入DNA分子量标准，以备。接通电泳仪电源，80V电泳15min，最后关闭电源，紫外灯下或者凝胶成像系统下进行观察或拍照。 2.2 猪HAL基因的PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测 2.2.1 PCR扩增猪HAL基因片段 Ⅰ PCR反应体系的配制 按照如下比例配制，反应体积为20 μL（也可以根据实际情况确定相应的体积）。各成分的初始浓度和用量如下（表1）： 表1 PCR反应体系（20 μL） 成分 最初溶度或者含量 体积(μL) 5×Buffer（含Mg2+） 5× 4 dNTPs 1.6 Taq DNA聚合酶 0.2 上游引物 10 nM/mL 0.4 下游引物 10 nM/mL 0.4 DNA模板 50 ng/μL 0.4 ddH2O 13 总体积 20 在配制上述溶液时，一般将除了DNA模板外的所有成分混合，均匀分装到灭菌的用于PCR扩增的Ep管中（0.2 mL规格）。 在分装好的Ep管中加入DNA模板，盖紧盖子，瞬时离心，使各成分混合均匀。 Ⅱ PCR反应程序 首先95 ℃预变性5 min，然后94 ℃ 变性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸40 s进行35个循环，最后72 ℃延伸5 min后冷却到4 ℃。 设置PCR反应程序时，主要是退火温度和延伸时间的设置，退火温度的设置是根据引物的性质进行，而延伸时间是根据扩增DNA片段长度设置，1 kb的延伸时间一般设定1 min。 2.2.2 琼脂糖凝胶电泳检测（同上） 2.3 猪HAL基因的突变检测（RFLP）（酶切-琼脂糖凝胶电泳） 经琼脂糖凝胶电泳检测后，PCR产物可以直接用于RFLP检测。 按HhaI内切酶说明书要求，取10 uL PCR产物，10× Buffer 2 uL，0.5 uL HhaI内切酶(10U/uL)，加水至20 uL，37℃温育3 h，3％1843位碱基突变点的DNA片段。当HAL基因未发生突变，即阴性纯合子（CC型），其GCGC序列就会被HhaI限制性内切酶 （酶切DNA序列是：5’GCG↓C3’）识别，从而将660bp的片段切割成495bp+165bp的两段条带。当两条染色体中的一条其C碱基突变为T时，即杂合子（TC），该链的酶切位点消失，变成变成5’GTGC3’，不能被HhalI切割，其长度依旧为660bp；另一条链正常，被HhalI切割为495bp+165bp，所以出现三条带链。而当两条染色体的C碱基完全突变为T时，即阳性纯合子（TT），酶切位点消失，变成5’GTGC3’，两条DNA长链均不可被HhalI切割，其长度都为660bp，本样品中没有出现该基因型。 图3 氟烷基因Hhal酶切琼脂糖凝胶电泳结果 讨论 在进行猪HAL基因的突变检测（RFLP）（酶切-琼脂糖凝胶电泳）时，电泳结果有些条带很不清楚，甚至没有显现出现，其原因可能是多方面的，主要原因可能是提取量不足而损耗严重；离心机转速不够DNA离取不彻底；电泳时间不够等。但实验结果基本符合现实。在现实生活中猪氟烷基因突变率是