杀菌剂生物测定技术解析.ppt

第三章 杀菌剂生物测定技术 供试菌种 杀菌剂生测的应用 杀菌剂生测方法 杀线虫生测方法 杀菌剂盆栽试验 杀菌剂田间药效试验 线虫 滤纸片 五、杀菌剂盆栽试验 特别是为某一特定病害寻求有效的防治药剂时，实际上不可能对供试菌进行选择，但以水平扩散法作生物定量测定，如抗菌素效价测定，则必须对供试菌有如下的要求： 对被测定的药剂有适当的敏感性，抑菌圈界限明显 培养容易，生长迅速不易为杂菌污染　不易发生变异 容易作成接种菌液（菌丝体或孢子悬浮液） 菌种有较强的耐热能力 2　对药剂的要求　 　 用抑菌圈法测定一种药剂的抑菌作用的大小，有一定的局限性。如与该药剂的理化性质有密切的关系。如是否容易扩散。若有很好的扩散性能，就能真实反映该药剂的杀菌毒力。如由于大多数抗生素都有一定的水溶性，因此，抑菌圈法为抗生素的科研和生产广泛采用。而有相当一部分杀菌剂的原药是不易溶解于水，故扩散性不好，要用该法，就要用适量的乙醇或丙酮溶解后，再用水稀释至所需的浓度。 有效好的水溶性 　 将不同浓度的药液和热的培养基混合，用这种含毒培养基培育病，以病原菌的生长进度的快慢来判定药剂的毒力大小。 （2）生长速率法原理 有2种： ①　菌落达到一定的大小所需时间， 　 ②　一定时间内菌落的直径大小。 病原菌生长的表示方法 优点： ①　操作比较简单　 ②　适用范围广，适用于乳油、水剂、可湿性粉剂等 ③　重复性好。只要操作认真，均可得到可靠的结果 生长速率法的优缺点 缺点： 对供试菌种要求严格，病菌要易于培养，生长较快且边缘　整齐、产孢子缓慢，而且是农业生产上重要的的病原菌。 对供试药剂要求，有一定的耐热性，遇热不易分解。 苹果腐烂病菌（Valsa mali） 小麦纹枯病菌（Rhzoctonia solani ） 棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporium） 葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodiella） 小麦全蚀病菌（Gaeumannomyces graminis） 辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici） 生长速率法常用的菌种 （1）制备菌饼：用无菌的打孔器在供试菌种边缘打下菌块即菌饼（在无菌条件下进行） （2）含毒培养基的制备：奖供试药剂稀释成一系列梯度浓度后，准确取一定量的药液加入到热的培养基中，混匀，倒入灭菌的小培养皿中（直径为6cm），待冷凝后即为含毒培养基 生长速率法 （3）移植菌饼　用接种针或消毒的摄子将菌饼反面（有菌丝的一面向下和培养基贴合）移植到带毒培养基平板上，一个培养皿最好接一个菌饼。 （4）测定菌落直径　恒温培养到预定时间后，取出培养皿测量菌落直径。每个菌落十字交叉测两次直径。 生长速率法示意图 菌饼 含药剂的培养基 菌饼 含毒培养基 纯生长量＝菌落直径－菌饼直径 　　　　对照的纯生长量－处理的生长量 抑制率＝――――――――――――X100 　　　　　对照的纯生长量 计算公式 将算出的各处理（浓度）的抑制率换成机率值，以对数表示浓度，用作图法或最小二乘法求出EC50或EC95，并以此比较毒力。 毒力方程的计算 　 在比较粗放的进行几种杀菌剂的毒力比较时，可以采用最低抑制浓度法。 （3）最低抑制浓度法 最小浓度法基本原理 　 是药剂按等比或等差级数系列浓度和培养基混合后接入供试菌，定温培养一定时间后，找出“终点”（明显地抑制供试菌生长发育的最高稀释倍数，即最低浓度）的那个浓度，即为最低抑制浓度。通过比较几种不同药剂的最抵抑制浓度即可比较其毒力。显然，最低抑制浓度最小的，其毒力最大。 根据培养基是固态还是液态又将最低抑制浓度法分为 液体培养基稀释法 固体培养基稀释法 　 取若干只灭菌试管，顺序编号，在每只试管中加入适合供试菌生长的液体培养基Nml，然后在第一号试管中加入一定浓度的供试药液Xml，充分混合后自第一管中取Nml放入第二管，充分混合后取Xml加入第3管，直到最后一管不加药液作为对照。自倒数第二管中取出Xml弃去不用，如此所得的一系列浓度顺序相差一倍。 液体培养基稀释法 在各管中加入供试菌悬浮液一滴，在该供试菌最适温度下培养一定时间，取出观察“终点”，一般以混浊度为准，即以某编号试管以下不再发生明显混浊现象，这一试管的浓度就是最低抑制浓度。 　1　　　　　　2　　　　　　3　　　　　4　　　　　5　　　　CK 用灭菌蒸馏水将供试药制按等比或等差级数稀释一系列药液浓度。分别取每种浓度的药液Xml分放50ml灭菌三角瓶，加入灭菌并冷至60左右的培养基Yml，立即摇匀倒入培养皿内凝固。用接种环沾取供试菌液进行划线培养，至一定时间后观察抑制病菌生长的