第讲目的基因的克隆与分离分析.ppt

生物技术的核心课程 第一讲 基因工程概论 第二讲 基因工程的主要技术 第三讲 基因工程的酶学基础 第四讲 基因克隆的载体与受体 第五讲 目的基因的克隆与分离 第六讲 克隆基因的检测与功能鉴定 第七讲 克隆基因的表达与产物纯化 第八讲 基因表达的调控 使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。 2. 菌种 用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。 3. 制备原理 4. 制备过程 培养大肠杆菌 OD600至0.3-0.4 On ice 5-10 min 4℃离心收集菌 用冰冷的60mM CaCl2重悬 4℃离心收集菌 4℃离心收集菌 分装、-70℃冻存 用冰冷的60mM CaCl2重悬 On ice 30 min 用冰冷的60mM CaCl2重悬 二、重组DNA导入大肠杆菌 （1）转化（transformation) 大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。 （2）转染（transfection) 大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。 1. 外源DNA导入细菌的几种方法 （3）转导（transduction) 借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。 每?g DNA转化成功的细菌克隆数。 3. 转化方法 2. 转化率 简单，但转化效率不高（106-108/?g DNA）。 （1）热休克法（heat shock） 转化效率高（高于109/?g DNA）。 （2）电转化法 electronporation 10ng载体DNA 100?L感受态菌 On ice混合，静置10分钟 42oC 1分钟 加入1mL LB培养基 37℃摇1小时 10-100?L转化液涂含抗菌素的平板 吸附DNA 摄入DNA （1）热休克法 LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6 冰浴15分钟，2℃离心集菌 冰冷的水重悬菌体 2℃离心集菌 冰冷的水重悬菌体 2℃离心收集菌体 少量冰冷的水重悬 分装成 50-300?L 电转仪调为2.5kV,25?F 脉冲控制器200-400? 0.5?g质粒DNA On ice混合 加入1mLSOC培养液 37℃中速震荡60分钟 10-100?L转化液涂含抗菌素的平板 转化 （2）电转化法 4. 平板培养基培养细菌 10-100?L转化液 涂于含抗菌素的平板 37℃过夜 环形重组质粒 质粒自我连接 线性载体或DNA片断进入细菌会被降解。 ① 环形质粒数 （1）重组质粒 5. 影响转化率的因素 ①生长状态 制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。 ②必须在冰冷的条件下制备。 要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。 ④储存感受态菌要在-70℃以下。 ③CaCl2处理 ⑤使用感受态菌时必须迅速融化。 融化后一般不能再次冻存使用。 （2）感受态细胞 （competent cells) 把重组的噬菌体?DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的?噬菌体颗粒。 6. 体外包装的噬菌体的转导 （1）体外包装（in vitro packaging） （2）转导（transduction） 通过受体菌细胞表面的?DNA接受器位点（receptor site)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。 cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32℃下培养细菌时能够保持溶源性。 但当温度升高到44℃-45℃时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，?DNA复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。 （3）cI857基因突变的?噬菌体 但由于该噬菌体的S基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。 cI857 其它基因 溶源状态（?DNA不转录、不翻译） ?DNA 阻遏 蛋白 阻遏 蛋白 44℃-45℃ ?DNA转录、翻译合成外壳蛋白 32℃ ?噬菌体1 外壳蛋白基因E发生了无义突变，不能合成头部蛋白，但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。 在cI857基因突变的?噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型?噬菌体。 （4）互补型噬菌体 外壳蛋白基因D发生了无义突变，不能合成头部的包装识别蛋白，但能合成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。 ?噬菌体2 (5) 体外包装过程 体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每?g ?DNA能形成106噬菌斑）。 （6）转导 转化率高的菌株； 有突变的菌株（与导入的载体基因互补）； 不育的菌株（不会与其他酵母接合）。 第七节 外源基因导入真核细胞 一、导入酵母细胞 1. 菌株选择 如：ura3-52, trp1-289, leu2-3, leu2-112, his3?1 （1）利用原生质球进行转化 2. 酵母的转化方法 酵母 原生质体 感受态 酶去壁 CaCl2、 PEG 插入外