个人整理总结神经细胞和胚胎细胞培养操作注意事项及相关protocols重点分析.doc

DrosophilaS2cellcultureprotocols陈文锋一、基本注意事项（一）无菌操作培养所需一切物品、液体应无菌。操作前先列出所需物品，培养液须室温平衡，所有物品准备好后再操作，避免往复拿取用品。有关数据的计算要事先做好。（二）操作区消毒进入细胞室内换穿里面的拖鞋。无菌培养室每周用0.2%的新洁而灭（苯扎溴铵）拖地面1次（拖布专用），紫外照射15-30min。超净工作台使用前后需用75%乙醇擦洗，然后进行紫外灯照射15~30min进行消毒，操作时打开风机。紫外照射期间不能放置培养细胞和培养液等。所有进入操作区域的物品需经75%乙醇擦拭消毒。工作台面均需经75%乙醇擦拭消毒，特别是液体溢出时，需立即擦拭。移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%乙醇擦洗后置于台内同时紫外照射消毒。废液缸、污物盒每次做完实验马上清理倒掉。（三）洗手和着装乳胶手套75%乙醇喷洒消毒。白大褂定期高温高压灭菌。（四）火焰消毒培养或其他无菌操作时，首先点燃酒精灯。安装管帽、打开或封闭瓶口等，都需要在火焰近处。二、细胞培养条件S2细胞培养在SchneidersDrosophilaMedium+10%FBS的培养基中+100U/ml青霉素+100ug/ml链霉素，25℃无需要CO2培养。五、FBS分装及灭活分装：初次买500ml血清，4℃完全融化（过夜差不多20h，时间比较长），期间间隔混匀。无菌操作分装于50ml离心管（直接倒，但是注意不要让血清瓶和离心管接触）。同时分装几管15ml的（15ml不好倒就用枪或移液管操作）。（-80℃保存）再次分装：等15ml的分装血清用完。把50ml的血清取出，4℃完全融化，期间间隔混匀。无菌操作分装于15ml离心管。灭活：把装有灭菌水的烧杯置于56℃水浴锅中，等水浴锅温度恒定，把装有血清的15ml离心管放于烧杯中，水位应超过血清的位置。灭活30min，每隔10min混匀一次。六、枪头、枪消毒枪头：细胞用1ml枪头为加长的枪头（放于507柜子上），细胞室有三个盒子可以装此枪头。其余型号枪头为普通枪头。装枪头时戴上手套尽量在507超净台操作，灭菌时一定用报纸包上。灭完烘干放回细胞室备用。枪：可高温高压灭菌。定期灭菌时包上锡箔纸高温高压灭菌后烘干。七、培养基配制Schneider’s/10%FBS/PS（抗生素可以不加）表1不同体积的完全培养配置Schneidermedium225ml450ml45mlFBS25ml50ml5ml青霉素125ul（20万单位/ml=200U/ul）250ul25ul链霉素125ul（0.2g/ml）250ul25ul青霉素链霉素每瓶加4ml每瓶加5ml分装300ul/管分装300ul/管1、450mlSchneider’s培养基（SigmaorGibco11720-034orLonza04-351Q）2、加入50mlFBS（热灭活过）。3、5ml1：100青霉素和链霉素。-20℃保存。（最终浓度为青霉素100U/ml，链霉素100ug/ml。一般市售青霉素为80万单位/瓶，将其溶解于4ml三蒸水中（20万单位/ml），每升培养基中加入0.5ml；市售链霉素为1克/瓶，将其溶解于5ml中（0.2g/ml），每升加入0.5ml）。接mini-Q水，过滤膜，然后溶解抗生素。4、0.2u过滤后4℃保存。八、培养箱设置培养箱中放置水盘保持一定湿度：水盘中用去离子水或灭菌蒸馏水配置2%的硫酸铜。水盘定期更换，保证水不会全部挥发干。九、消毒液配置75%乙醇配置（手、超净台台面消毒）：210毫升的纯净水＋790毫升的95%乙醇＝1升75%乙醇溶液。0.2%新洁尔灭配置（地板、台面等消毒）：500ml新洁尔灭+7000ml蒸馏水250ml新洁尔灭+3500ml蒸馏水100ml新洁尔灭+1400ml蒸馏水50ml新洁尔灭+700ml蒸馏水十、解冻细胞（细胞复苏）每个冻存管大约有1ml细胞悬浮液（大约2×107个/ml）。解冻细胞程序：1、把冰箱中的培养基提前15-30min恢复至室温。吸取5ml完全培养基于T-25培养瓶。（DGRC有推荐培养基用量，见附件1）注：用60mm培养皿+4ml培养液也行，但是对于长得慢的细胞不推荐，因为培养皿容易挥发水蒸气。2、用枪头吸取一定量培养液于冻存管，吹打混匀细胞。把细胞吸取到培养瓶或培养皿。注：不推荐用水浴的方法解冻细胞。把培养瓶放于培养箱中1-2h。3、倒置显微镜下观察细胞状况。通常，大多数细胞在这个时候松弛地贴壁。如果是这样，轻轻地移除上清，换新的培养基。这步的目的是移掉DMSO（对细胞有毒）。把培养瓶放回培养箱过夜，第二天重复前步操作。注：S2细胞对DMSO不敏感，但是换培养液可移除冻过不好的细胞。注：如果1-2h之后看细胞还是悬浮，用离心的方法移除掉漂浮