第九章核酸的分离与提纯教材.ppt

核酸的种类 脱氧核糖核酸（DNA）：细胞核，单链或双链  核糖体RNA 核糖核酸（RNA） 转运RNA 信使RNA 但无论哪核酸，在生物体中一般以核蛋白的形式存在， 因此，为了提取制备核酸，必须将核蛋白解联（即利用接联剂将核蛋白裂解为核酸和蛋白）并去除蛋白， 同时必须维持核酸的天然性状，不使核酸发生变性或降解， 操作上尽量简化操作步骤，缩短操作时间，以减少各种不利因素对核酸的破坏，同时要求去蛋白迅速彻底。 为了保证分离核酸的完整性及纯度，在实验过程中，应注意以下条件和要求： （1）尽量避免化学因素对核酸的降解 过酸或过碱以及其他化学因素将破坏多聚核苷酸链的磷酸二酯键，使核酸降解； 核酸（特别是RNA）在碱性溶液中十分容易降解. 因此抽提介质的pH常以5.5-9.0为宜。 （2）减少物理因素对核酸的降解 物理因素主要是机械剪切力，包括强烈震荡、搅拌、细胞突然置于低渗溶液中，以及让溶液快速通过狭长的孔道； 其次是冻融、高温煮沸和辐射等，均将导致核酸的降解。 机械剪切力主要破坏大分子量的线性DNA分子，而对分子量小的环状质粒DNA及RNA分子，破坏相对较小。 (3)防止核酸的生物降解 细胞内外各种核酸酶可作用于磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构，使其降解； DNA酶需要Mg 2+、Ca 2+的激活，因此实验中常加入EDTA、柠檬酸盐，以络合核酸酶作用时所必需的Mg 2+离子，以抑制DNA酶的活性； 制备RNA则需克服核糖核酸酶（RNase）的降解作用。因为RNase不但分布广泛，极易污染，而且耐高温，即使加热到蛋白变性， Rnase的活力也不会完全丧失，且具有惊人的回复力，而细胞内的核蛋白又总是和它联在一起，若去除不彻底，它将部分恢复活力，导致RNA降解。 生物降解是RNA提取过程的主要危害，储存的RNA制品也不例外，因此，为了抑制核酸酶的活性，一般在低温下（4℃或0℃，甚至-20 ℃左右）进行。 进行核酸分离时最好用新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料置液氮中或-80 ℃冰箱保存。 分离纯化核酸总的原则 一是应保证核酸一级结构的完整性，这是研究核酸结构与功能的最基本要求； 二是要排除蛋白质、脂类、糖类等其他物质的污染。 纯化的样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂或过高浓度的金属离子； 蛋白质、脂类、糖类等的污染应降低到最低程度； 无其他核酸的污染，如提取DNA时，应去除RNA。 第二节 核酸制备的基本方法 核酸制备的步骤 （1）抽提组织或细胞的破碎、消融。 抽提核酸必须事先将生物材料破碎或消融，这关系到核酸回收率的高低。 破碎与消融组织细胞，通常有使用匀浆器、捣碎器的机械方法以及温和的反复冻融法，使用表面活性剂或各种酶处理的方法。 （2）抽提核酸，去除与核酸结合的蛋白质、多糖、脂类，去除盐、有机溶剂等杂质，以及去除其他不需要的核酸分子； （3）核酸的精制纯化。 一、细胞的破碎 一般动物组织的细胞膜较脆弱，易破碎，而植物和微生物的细胞比较牢固。 细胞破碎的方法很多，可根据组织特性和核酸分离目的加以选择。 1．物理方法 (1)机械碾碎 对于动物组织(如鼠肝、兔肝等)，一般多采用匀浆的方法。即将组织剪碎置研钵中，研碎。 为了提高研磨效果，可加入一定量的石英砂。但要注意石英砂对有效成分的吸附作用。 用匀浆器处理，也能把动物细胞破碎，此法较温和，适于实验室应用。 若需大规模生产，则可用电动研磨法，酵母、植物组织的细胞破碎也可用此法。 (2)组织捣碎器法 是一种剧烈的破碎细胞的方法。 捣碎器(8 000-10 000 r/min)处理30～45s，植物和动物细胞能完全破碎。 若用它破碎酵母菌和细菌的细胞，则需加入石英砂方才有效。 在捣碎期间必须保持低温，以防温度升高引起有效成分变性，同时捣碎的时间不宜太长。 (3)超声波法 是借助声波的振动力破碎细胞壁和细胞器的有效方法。 由于细菌的外部有一层细胞壁，破壁较为困难，因此用超声波处理细菌和酵母的时问要长一点。有些菌体破碎需要5～l0min或更长，如果在细胞浮液中加石英砂则可缩短时间。 为了防止电器长时间运转产生过多的热量，常采用间歇处理和降低温度的方法进行。 (4)压榨法 是一种温和、彻底破碎细胞的方法。 即用高压迫使几十毫升细胞悬液通过一个小于细胞直径的小孔，致使细胞被挤压破碎。 2．溶胀和自溶 (1)溶胀 概念：在低渗溶液，如低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子将大量进入细胞，致使细胞膜膨胀破裂的现象称为溶胀。 步骤：将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出至室温下(或40℃左右)