秀丽线虫的研究和饲养介绍.pptVIP

秀丽隐杆线虫的饲养及研究用途 By 王传杰 介绍 秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）,属于线形动物门、线虫纲。体形非常小,成虫只有1mm左右。 线 虫 是 细 胞 定 数 动 物 ， 两性 成虫 只有 9 5 9 个 体 细 胞 ， 雄 性 成 虫 只 有 1 0 3 1 个 体细 胞 ， 其 中 1 3 1个 细 胞 注 定 要 接 一 定 的发 育 程 序 陆续 死 亡 。 神 经 系统解 剖结 构 十 分 简 单 ， 仅有 3 0 2个细 胞 ， 约 占整 个 动 物 体 细 胞 总 数 的 三 分 之 一 。它身体透明,能感知气味和味道,对光线、温度有反应。研究者很容易在显微镜下对其细胞和组织进行跟踪观察 饲养与冻存 设备试剂： 大肠杆菌OP50 —— 大肠杆菌OP50是尿嘧啶渗漏突变型,作为秀丽隐杆线虫的食物。 NGM培养基——1000ml的NGM培养基内加有:3gNaCl,2.5g蛋白胨,17g琼脂,1mol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH=6.0)25ml,975ml蒸馏水,灭菌后加入分别抽滤除菌的1ml胆固醇溶液(5mg/ml乙醇),1mol/LMgSO41ml,1mol/L的 CaCl 21ml M9缓冲液——每升缓冲液中含15.12gNa2HPO4#12H2O(或6gNa2HPO4),3gKH2PO4,5gNaCl,0.25gMgSO4#7H2O,宜现用现配 S缓冲液——0.1mol/LNaCl,0.05mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液(pH=6.0) 喂养方法 用冰M9缓冲液清洗虫体 置4℃环境20min 1000r离心，弃上清,沉淀物用M9缓冲液重悬 置4℃环境20min 弃上清 取200ul沉淀物以靠接法接种到涂有大肠杆菌OP50的NGM培养基上 将培养基放置到16℃生化培养箱中，72h后可繁育至第二代 冻存 准备1mlEP管，加入700ul30%甘油（s缓冲液溶解） 用冰M9缓冲液清洗虫体 置4℃环境20min，1000r离心弃去上清 将虫体转入事先准备好的EP管中，置于-80℃冰箱冻存（可保存2个月），需要时取出室温解冻重置培养基 研究范围 细胞程序性死亡的遗传调控机制 RNAi 及其作用机制 秀丽线虫的功能基因组学及其他研究 低氧应答模式生物 基因组学和功能蛋白组学的研究 其他（MAPK 信号传导 、 TGF- b 信号传递途径 、衰老和年龄及脂肪代谢等） 方法 —— 线虫基因显微注射 显微注射技术是线虫研究领域的常用技术，对线虫进行转基因操作的一种高效且相对简单的方法，主 要用于研究线虫突变种系的功能恢复(mutant rescue)、特定基因的过表达或异位表达、标 签 蛋白的 表达、特 定 蛋白 质 结构域的功 能、DNA 或 RNA 调节元件的分析及 RNA 干扰等． 此外，这项转基因技术对于特异表型的筛选也是个强有 力 的 工具 ， 并 且 它还 可 用于 将人 工 合 成 mRNAs 或其他分子接引入细胞 设备 显微注射全套仪器 琼脂糖固定垫 添 加 了 4% 葡萄糖 (glucose) 的 M9 缓 冲液 注射步骤 制剂及破针 固定虫 将纯化的 DNA 溶解在 Tris-EDTA(TE)缓冲液中即可接用于注射。在注射液中加入终浓 度约 10 mg/L 的线虫基因组 DNA，则会有效地提高转基因效率。 将一小玻片放在加了注射油的固定垫上，操纵微操使注射针与玻片边缘相撞，若针头尖端撞破，可观察到有液泡自动渗出 注射时将线虫挑至琼脂糖固定垫上，调整线虫使性腺暴露，滴加注射油覆盖整个虫体． 固定好后的操作要迅速，否则线虫容易脱水而死 ． 将琼脂糖固定垫放在载物台上，40x物镜下找到线虫，使性腺聚焦在正确的平面． 操作微操或轻移滑动载物台，将注射针尖刺入性腺． 启动微量加压器进行注射，能观察到注射液在性腺中快速流动，注射后的性腺被液体充满． 在体视显微镜下，滴加恢复缓冲液至注射后的线虫正上方，由于与油互不相溶，缓冲液会渗入油下使线虫浮起． 一般等待 2～ 5 min，线虫活力恢复，身体开始游动，即可挑至培养板上，20℃ 常规培养． 注射 恢复 琼脂糖固定垫 取约 50 ul 加热溶解的 2%琼脂糖(agarose)溶液滴在长宽 50 mmx24 mm，厚 0.13～ 0.17 mm 的载玻片上，用另一载玻片轻压其上，待琼脂糖凝固后( 约 2 min)，将上