第二章 基因工程操作常规技术2(方)综述.pptVIP

PCR不只是一个方法改进 Mullis的上司有句“名言”，“我们要扩增这么多DNA样品有什么用”； 到了1991，Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关专利转让给瑞士Hoffman LaRoche公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红； Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA重组技术一样意义深远。 PCR仪器的变迁 三个水浴锅， 用手移动 （Mullis等人当时用的） 电加热块 ＋ 自来水冷却 （PE，1988） 电加热块 ＋ 内置循环液冷却 （PE，1989） 三个加热块 ＋ 机械手 （Stratagene，1994） 半导体制冷和加热 （MJ, PE, BioMetra, Eppendrof） 温度梯度, 荧光检测 (如 Roche的Lightcycler) 风加热 Lab-on-chip式的PCR仪(所谓的芯片PCR) 中国的状况 1991年出现三个水浴锅+机械手的原始PCR仪（华美，复日等） 现在以半导体（Peltier板）制冷式为主（杭州博日,上海天呈, 厦门安普利等） 用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG的尾巴，然后分别用多聚dC和已知的序列作为引物进行PCR扩增。 PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5－3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 实时荧光定量PCR仪（TL988型） 临床疾病诊断： 各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病等传染病诊断和疗效评价；地中海贫血、血友病、性别发育异常、智力低下综合症、胎儿畸形等优生优育检测；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断；遗传基因检测实现遗传病诊断。 动物疾病检测： 禽流感、新城疫、口蹄疫、猪瘟、沙门菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、寄生虫病等、炭疽芽孢杆菌。 食品安全： 食源微生物、食品过敏源、转基因、乳品企业阪崎肠杆菌等检测。 科学研究： 医学、农牧、生物相关分子生物学定量研究。 应用行业： 各级各类医疗机构、大学及研究所、CDC、检验检疫局、兽医站、食品企业及乳品厂等。 到2030年，预计只要1000美金就能得到个人的基因组序列。人与人之间平均1000个碱基对就有一个碱基呈多态性(SNP)。因此共有300万碱基上可能存在差异, 而真正有价值的SNP也许只有1－2万个。 防治基因信息的滥用和基因歧视，将是今后社会的重任。 ? 灵敏度高 1.皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平 2. 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 ? ? 简便、快速 1.一次性加好反应液，2～4 小时完成扩增 2.扩增产物一般用电泳分析 对标本的纯度要求低 ?血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA PCR的特点 PCR的应用 ? 研究 – 基因克隆，DNA测序，分析突变 ? 诊断 – 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 ? 人类基因组工程 – 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 ? 法医 – 犯罪现场标本分析 ? 肿瘤 – 各种肿瘤检测 ? 其他…… 1) 基因克隆 重组DNA 质粒DNA 基因片段 2) 基因检测 内源性病变基因 A A’ 正常人 病人 人 病原微生物基因 正常人 (-) 病 人 (+) 遗传病的诊断 地中海贫血 珠蛋白链合成不平衡 HBA1、HBA2 第11号染色体上的HBB基因 恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因） PCR-RFLP（限制性核酸片段多态性）法： 限制性内切酶 Ras基因 突变 限制性内切酶 正常 突变 电 泳 父 父 子 母 亲子鉴定 现 嫌1 嫌2 嫌3 犯罪现场调查 1）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究 PCR的类型 限制性引物 (低浓度引物) 高浓度引物 低浓度引物 2)反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互