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2012年河南省猪流行性腹泻病毒分离株Sl基因遗传变异分析
赵雪丽1,陈慧娟L 2,闫若潜1,赵明军1,周兵强1,靳利粉1,吴志明强
(1.河南省动物疫病预防控制中心,河南郑州450008,2.河南农业大学牧医工程学院,河南郑州I
450002:)
摘要:为分析2012年河南省猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传变异情况,本研究设计合成2对扩增Sl基因的特异性引物,
利用RT~PcR方法,对2012年分离的5株PEBV毒株的Sl基因进行扩增、克隆和序列测定,并对其进行遗传进化分析。结果
表明:5株PEDV S1基因核苷酸和氨基酸同源性分别为98.3%~99.5%和97.1%~98.9%,与201t年以来国内登录的PEDV
流行变异株核苷酸同源性为97.8%~99.2%,氨基酸同源性为97.4%~99.1%。与经典毒株CV777核苷酸同源性为88.7%~
89.1%,氨基酸同源性为87.3%~88.4%。5株分离株S1基因均存在相同的插入和缺失,与2011年以来国内登录的流行变
异毒株相比没有大的变异,但与参考毒株CV777相比较,在第163一166 bp处有3个核苷酸插入,在173—174 bp之间有9
个核苷酸插入,在405—406 bp之间有3个核苷酸插入,在463—464 bp之间有3个核苷酸缺失,这些位点核苷酸的插入
和缺失导致了其编码的氨基酸相应改变。Sl基因系统进化树分析表明,5株分离株与2011年以来国内登录的流行变异毒
株均属于基因III群,与2011年国内登录的少部分PEDV基因I群流行毒株的核苷酸同源性为88.6%~89.3%,氨基酸同源
性为85.3%~86.9%,而经典毒株CV777所在分枝群属于基因II群。表明2011年以来,我国流行的PEDV毒株中同时有基因
和I群的存在,但以基因III群毒株为主,其致病性和抗原性差异仍有待迸一步研究。
关键词:猪流行性腹泻病毒:Sl基因;遗传变异i分析
猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(poreine epidemic
diarrhea virus,PEDV)引起的以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的~种高度接
触性肠道传染病(Pensaert等,1978)。PEDV属于冠状病毒科(CoroflavJridae)冠状病毒属
(Coronavirus)的成员,主要引起各种年龄、各个品种猪的腹泻,哺乳仔猪、架子猪、育肥猪的发
病率均可达90%,出生l~2周仔猪的致死率可达90%以上,成年母猪发病率为15%--90%,而致死率
较低(Chaec等,2000)。研究结果表明,PEDV在亚洲与欧洲的致病情况有所差异,在欧洲PEDV引起
的仔猪死亡率较低,而在亚洲PEDV引起的仔猪死亡率较高,并且在中国PEDV感染更加严重,其感染
率明显高于猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)(Carvajal等,1995;陈建飞等,2007)。
该病毒表面具有3种结构蛋白:纤突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)。其中S蛋白在受体细胞结
合吸附、膜融合等方面发挥重要作用,也是诱导机体产生保护性中和抗体的主要免疫蛋白(Kang等,
2005)。根据其他冠状病毒蛋白保守的基序可以将S蛋白划分为Sl区(1~789位氨基酸)和S2区
(790—1383位氨基酸)(Timoney等,19s8)。研究表明冠状病毒S1基因的变化更能够体现病毒的变
异情况,所以对PEDV S1基因的研究至关重要(Shibata等,
2000)。
2010年以来,以PEDV为主要病原的仔猪腹泻在我国多数已免疫过PEDV灭活疫苗和弱毒疫苗的
猪场中发生(张志等,2012)。因此,研究当前流行PEDV毒株的分子遗传变异规律及其致病性特征对
有效防控当前流行的仔猪流行性腹泻病具有重要意义。鉴于此,本研究从2012年河南省自发生仔猪
腹泻疫病的猪群中分离鉴定的PEDV毒株中筛选出5株PEDV,并对其S1基因进行了克隆、序列测定
和遗传进化分析,以研究河南省PEDV的遗传变异情况,为进一步防控猪流行性腹泻疫病提供依据。
1材料与方法
1.1毒株样品
无菌采集2012年河南省不同地区猪场中发生严重腹泻、呕吐、脱水和死亡等疑似流行性腹泻
发病猪的粪便或小肠内容物等56份阳性样品,过滤除菌后接种Veto细胞,72 h收毒,并进行细胞
传代培养,经病毒分离与鉴定,成功分离出5株PEDV分离株。
1.2主要材料
RNA提取用Trizol购自Invitrogen公司;反转录试剂盒、dNTPs、Ex
Taq
DNA聚合酶、T4
DNA
连接酶、DL2000 DNA Marker、pGEM—T克隆载体、E.coli DH5 Q菌
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