2012年河南省猪流行性腹泻病毒分离株S1基因遗传变异的分析.docVIP

２０１２年河南省猪流行性腹泻病毒分离株Ｓｌ基因遗传变异分析 赵雪丽１，陈慧娟Ｌ ２，闫若潜１，赵明军１，周兵强１，靳利粉１，吴志明强 （１．河南省动物疫病预防控制中心，河南郑州４５０００８，２．河南农业大学牧医工程学院，河南郑州Ｉ ４５０００２：）  摘要：为分析２０１２年河南省猪流行性腹泻病毒（ＰＥＤＶ）的遗传变异情况，本研究设计合成２对扩增Ｓｌ基因的特异性引物， 利用ＲＴ～ＰｃＲ方法，对２０１２年分离的５株ＰＥＢＶ毒株的Ｓｌ基因进行扩增、克隆和序列测定，并对其进行遗传进化分析。结果 表明：５株ＰＥＤＶ Ｓ１基因核苷酸和氨基酸同源性分别为９８．３％～９９．５％和９７．１％～９８．９％，与２０１ｔ年以来国内登录的ＰＥＤＶ 流行变异株核苷酸同源性为９７．８％～９９．２％，氨基酸同源性为９７．４％～９９．１％。与经典毒株ＣＶ７７７核苷酸同源性为８８．７％～ ８９．１％，氨基酸同源性为８７．３％～８８．４％。５株分离株Ｓ１基因均存在相同的插入和缺失，与２０１１年以来国内登录的流行变 异毒株相比没有大的变异，但与参考毒株ＣＶ７７７相比较，在第１６３一１６６ ｂｐ处有３个核苷酸插入，在１７３—１７４ ｂｐ之间有９ 个核苷酸插入，在４０５—４０６ ｂｐ之间有３个核苷酸插入，在４６３—４６４ ｂｐ之间有３个核苷酸缺失，这些位点核苷酸的插入 和缺失导致了其编码的氨基酸相应改变。Ｓｌ基因系统进化树分析表明，５株分离株与２０１１年以来国内登录的流行变异毒 株均属于基因ＩＩＩ群，与２０１１年国内登录的少部分ＰＥＤＶ基因Ｉ群流行毒株的核苷酸同源性为８８．６％～８９．３％，氨基酸同源 性为８５．３％～８６．９％，而经典毒株ＣＶ７７７所在分枝群属于基因ＩＩ群。表明２０１１年以来，我国流行的ＰＥＤＶ毒株中同时有基因 和Ｉ群的存在，但以基因ＩＩＩ群毒株为主，其致病性和抗原性差异仍有待迸一步研究。 关键词：猪流行性腹泻病毒：Ｓｌ基因；遗传变异ｉ分析 猪流行性腹泻（ｐｏｒｃｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ，ＰＥＤ）是由猪流行性腹泻病毒（ｐｏｒｅｉｎｅ ｅｐｉｄｅｍｉｃ ｄｉａｒｒｈｅａ ｖｉｒｕｓ，ＰＥＤＶ）引起的以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的～种高度接 触性肠道传染病（Ｐｅｎｓａｅｒｔ等，１９７８）。ＰＥＤＶ属于冠状病毒科（ＣｏｒｏｆｌａｖＪｒｉｄａｅ）冠状病毒属 （Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）的成员，主要引起各种年龄、各个品种猪的腹泻，哺乳仔猪、架子猪、育肥猪的发 病率均可达９０％，出生ｌ～２周仔猪的致死率可达９０％以上，成年母猪发病率为１５％－－９０％，而致死率 较低（Ｃｈａｅｃ等，２０００）。研究结果表明，ＰＥＤＶ在亚洲与欧洲的致病情况有所差异，在欧洲ＰＥＤＶ引起 的仔猪死亡率较低，而在亚洲ＰＥＤＶ引起的仔猪死亡率较高，并且在中国ＰＥＤＶ感染更加严重，其感染 率明显高于猪传染性胃肠炎病毒（ＴＧＥＶ）和猪轮状病毒（ＰｏＲＶ）（Ｃａｒｖａｊａｌ等，１９９５；陈建飞等，２００７）。 该病毒表面具有３种结构蛋白：纤突蛋白（Ｓ）、膜蛋白（Ｍ）、包膜蛋白（Ｅ）。其中Ｓ蛋白在受体细胞结 合吸附、膜融合等方面发挥重要作用，也是诱导机体产生保护性中和抗体的主要免疫蛋白（Ｋａｎｇ等， ２００５）。根据其他冠状病毒蛋白保守的基序可以将Ｓ蛋白划分为Ｓｌ区（１～７８９位氨基酸）和Ｓ２区 （７９０—１３８３位氨基酸）（Ｔｉｍｏｎｅｙ等，１９ｓ８）。研究表明冠状病毒Ｓ１基因的变化更能够体现病毒的变 异情况，所以对ＰＥＤＶ Ｓ１基因的研究至关重要（Ｓｈｉｂａｔａ等， ２０００）。 ２０１０年以来，以ＰＥＤＶ为主要病原的仔猪腹泻在我国多数已免疫过ＰＥＤＶ灭活疫苗和弱毒疫苗的 猪场中发生（张志等，２０１２）。因此，研究当前流行ＰＥＤＶ毒株的分子遗传变异规律及其致病性特征对 有效防控当前流行的仔猪流行性腹泻病具有重要意义。鉴于此，本研究从２０１２年河南省自发生仔猪 腹泻疫病的猪群中分离鉴定的ＰＥＤＶ毒株中筛选出５株ＰＥＤＶ，并对其Ｓ１基因进行了克隆、序列测定 和遗传进化分析，以研究河南省ＰＥＤＶ的遗传变异情况，为进一步防控猪流行性腹泻疫病提供依据。 １材料与方法 １．１毒株样品 无菌采集２０１２年河南省不同地区猪场中发生严重腹泻、呕吐、脱水和死亡等疑似流行性腹泻 发病猪的粪便或小肠内容物等５６份阳性样品，过滤除菌后接种Ｖｅｔｏ细胞，７２ ｈ收毒，并进行细胞 传代培养，经病毒分离与鉴定，成功分离出５株ＰＥＤＶ分离株。 １．２主要材料 ＲＮＡ提取用Ｔｒｉｚｏｌ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；反转录试剂盒、ｄＮＴＰｓ、Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、Ｔ４ ＤＮＡ 连接酶、ＤＬ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ、ｐＧＥＭ—Ｔ克隆载体、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ Ｑ菌