第七章酵母基因工程要点.pptVIP

第七章 酵母菌的基因工程 Dividing Saccharomyces cerevisiae (baker’s yeast) cells ① 能在E.coli中克隆和扩增。 一. 酵母克隆载体 Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+; ④ 有合适的克隆位点。 ③ 有酵母的选择标记 Ori ②有大肠杆菌的选择标记 Ampr、Tetr。 由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片断（选择标记）构成。 ColE1 酵母Leu 2+ 如 PYeleu10: （1）整合型载体(YIp) ①转化率低（1-10转化子/微克DNA）。 特点： 载体上只有细菌的复制区，没有酵母的自主复制区。 可与受体细胞的染色体DNA同源重组，随染色体一起复制。 ②不能在酵母细胞中自主复制 ③整合到酵母的染色体上 ④不能从酵母细胞中提取载体。 由大肠杆菌质粒和酵母的DNA片断(选择标记和酵母DNA自主复制顺序ARS）构成。 大肠杆菌质粒 酵母ARS （2）复制型载体(YRp) 酵母选择标记 ARS ARS（automously replicating sequence）: ATTTTATATTTA T G T 250bp 保守区 特点： ①转化率高（102-103转化子/微克DNA) 。 ④不稳定，容易丢失。 ②可从大肠杆菌和酵母中提取质粒。 既能在大肠杆菌中复制，又能在酵母细胞中自主复制。 ③穿梭载体（shuttle vector） 在YRp质粒中插入酵母染色体的着丝粒区。 特点： YRp质粒 酵母着丝粒 （3）着丝粒质粒(YCp) ③不易从细胞中提取。 ①行为像染色体，能稳定遗传。 ②单拷贝存在。 由大肠杆菌质粒、2?m质粒及酵母染色体DNA选择标记构成。 大肠杆菌质粒 酵母选择标记 2?m质粒 如pYF92: pBR322 2?m 酵母his 3+ （4）附加体型载体(YEp) 2?m质粒： 酿酒酵母的内源质粒，长度是2?m 。含有自主复制起始区ori和STB序列（使质粒在供体中维持稳定）。 特点： ①很高的转化活性（103-105转化子/微克DNA）. ②拷贝数多（25-100分子/细胞）。 ③比YRp稳定。 YEp24 Leu- 酵母 原生质体 感受态 酶去壁 CaCl2、 PEG 整合到染色体上， 或独立在酵母细胞内 转化 Leu营养缺陷型 培养基筛选 转化子克隆生长 酵母载体 大肠杆菌 提取 插入外源基因 鉴定克隆 发酵表达 外源基因产物 分离、纯化 二. 酵母转化和表达的一般过程 大多数是以酵母菌氨基酸或碱基合成途径中的结构基因作为选择标记，如lue2，trp1， his3和 ura3 。使用这些遗传标记时，受体菌应是相应标记基因的突变型，且是稳定的突变体（缺失突变或多点突变），利用遗传互补进行转化体选择的。 组氨酸his3—咪唑磷酸甘油脱氢酶; 亮氨酸lue2—β-异丙基苹果酸脱氢酶; 赖氨酸lys2—β-氨基已二酸还原酶; 色氨酸trp1—N-邻氨基苯甲酸异构酶; 尿嘧啶ura3—乳清苷-5`-磷酸脱羧酶; 三.用于转化子筛选的标记 亮氨酸lue2—β-异丙基苹果酸脱氢酶 该酶是把丙酮酸转化成亮氨酸的代谢酶之一．只要使用亮氨酸lue2突变的营养缺陷型酵母作受体，载体上带有亮氨酸lue2基因就能在不含亮氨酸的培养基上实现转化克隆的筛选（书１７０页图）． （1）优点 ①对其遗传学和生理学的研究比较深入。 ②小量培养和大规模反应器中都能生长。 ③已经分离出很强的启动子。 ④有翻译后的加工。 ⑤本身自然分泌很少，便于胞外蛋白的纯 化。 ⑥安全性高（FDA确认的安全生物），不 需要宿主的安全性检验。 四. 酵母表达系统的特点 ②常常发生质粒丢失。 ③重组蛋白常常超糖基化 ①表达量普遍低。 （2）缺点 每个N-寡糖链上含有100多个甘露糖， ④分泌困难。 正常的高甘露糖寡糖链上仅有8-13个甘露糖。 分泌型蛋白有时会留在壁膜间隙， 诊断试剂 丙肝病毒蛋白 HIV-1抗原 种类 名称 疫苗 乙肝病毒表面抗原 疟原虫环子孢子蛋白 HIV-1外壳蛋白 五. 在啤酒酵母中表达的重组蛋白 人类治疗用蛋白药物 上皮生长因子 胰岛素 类胰岛素生长因子 血小板源生长因子 胰岛素前体 成纤维细胞生长因子 集落刺激因子 ?1抗胰蛋白酶 凝血因子VIIIa 24 （1）乙肝表面抗原在嗜甲烷酵母中表达 嗜甲烷酵母（Pichia pastoris）的特点 在大型发酵反应器中容易生长； 以甲醇作唯一的碳源和能源，成本低。 有甲醇时，表达的乙醇氧化酶高达胞内总蛋白的40%！ HBsAg: 乙肝表面抗原。可以作为疫苗。 Aox1：乙醇氧化酶基因1启动子（受甲醇激活