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基因工程Gene Engineering 温州医科大学生命科学院 主要内容 第一节 工具酶 第二节 载体 第三节 分子克隆的基本步骤 第四节 基因工程的应用 第一节 工具酶 限制性核酸酶内切酶 DNA聚合酶 DNA连接酶 碱性磷酸酶 核酸酶S1 第二节 载体 载体应具备的特征： 人工合成基因的局限性 长度有限 密码子兼并性 二级结构影响拼接 费用较高 (二) 平末端连接 三、转染(transfection) 指真核细胞由于外源DNA掺入而获得新的遗传标志的过程。常规转染技术可分为瞬时转染和稳定转染（永久转染）两大类。 裸鼠身上的人造耳朵 人造耳朵？人造大脑？让人怀疑，是不是人造器官的时代已经到来？ 如果有一天，全身上下的“零件”都脱胎换骨的打制成“人造”器官，那岂不是将是一个“人将不人”的时代？ 重点内容 中心法则(central dogma) 基因（gene） 基因组（genome） 转座因子 质粒（plasmid） 假基因（pseudo gene） 比较基因组学 宏基因组学（metagenomics） 蛋白质组（proteome） 载体（vector ） 穿梭载体 （shuttle vector） 感受态细胞(competent cell) 转化（transformation） 基因的分类与结构 病毒基因组的结构特点 真核生物基因组的结构特点 蛋白质组学研究流程 双向凝胶电泳的基本原理 质谱分析基本原理 酵母双杂交基本原理 工具酶的种类和功能 载体的分类和条件 分子克隆的基本步骤 蓝白斑筛选的原理 重组子结构特征筛选 英国伦敦的一个研究小组把一个来自Y染色体的 Sry基因注入基因型为雌性的鼠的胚胎内，结果 令人吃惊。这些本来应该发育成雌鼠的胚胎最 后竟都长成了雄性鼠。这个结果表明，Sry基因 是决定雄性性别的基因。科学家猜测，这个基 因很可能在人类中也起着同样的作用。 转基因动物与基础生物学研究 第四节 基因工程的应用二、动植物基因工程 转基因植物 第四节 基因工程的应用二、动植物基因工程 我国已有人干扰素、人白介素 2、人集落刺激因子、重组人乙型肝炎疫苗、基因工程幼畜腹泻疫苗等多种基因工程药物和疫苗进入生产或临床试用 世界上还有几百种基因工程药物及其它基因工程产品在研制中，成为当今农业和医药业发展的重要方向，将对医学和工农业发展作出新贡献 第四节 基因工程的应用三、微生物基因工程和发酵工业 第四节 基因工程的应用三、微生物基因工程和发酵工业 （二）逆转录法 本法是应用得最多的获取目的基因的方法。但前提是目的基因的序列已知，至少部分已知。 选用富含目的基因mRNA的细胞作为实验材料，有利于分离到目的基因。如胰岛素基因的mRNA主要存在于胰腺组织，血红蛋白基因的mRNA占网质红细胞总mRNA的50%~90%。用此法得到的目的基因进行克隆可获得较完整的连续编码顺序，易在宿主细胞中表达及筛选。 第三节 分子克隆的基本步骤一、 目的基因的获取 （三）人工合成DNA片段 根据已知某种基因的核苷酸序列或某种基因产物的氨基酸序列，可推导出为该多肽编码的核苷酸短序列，再用DNA合成仪人工合成目的基因。此法适用于合成分子量较小的目的基因 （100bp以内），如：人生长激素释放因子、血管加压素、干扰素、胸腺素及胰岛素原的基因等。 第三节 分子克隆的基本步骤一、 目的基因的获取 （四）直接从染色体DNA中分离目基因 根据染色体DNA的限制性内切酶图谱，用适当的限制性内切酶切割染色体DNA、分离目的基因。本方法较适用于制备原核生物目的基因，其原因为： （1）真核细胞染色体DNA有丰富的内含子，它们在原核细胞中转录后不能被剪接。 （2）真核细胞的基因多数为单拷贝，难以分离到足够量的目的基因。 第三节 分子克隆的基本步骤一、 目的基因的获取 ?噬菌体和粘性质粒载体常用来构建基因组文库， 构建cDNA文库和克隆较小DNA片段常用pUC系列等质粒， 3. M13噬菌体则用于克隆一些待测的DNA序列。 第三节 分子克隆的基本步骤二、 载体的选择 (一)粘性末端连接 第三节 分子克隆的基本步骤三、 目的基因和载体酶切与连接 方式： (1)单酶切 　(2)双酶切 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 单酶切 目 录 双酶切 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 D