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相互作用蛋白质组学 唐冬雪 2016-06-07 蛋白质是生命过程的真正执行者，蛋白质相互作用与生命健康息息相关。因此，蛋白质互作研究也是基础生命科学的一个重点研究领域. 生物体的生理功能主要由细胞中的蛋白质控制和调节。其中，多数蛋白质是通过与配体结合或是作为蛋白质复合物中的一部分参与细胞的代谢过程。因此，研究蛋白质间的相互作用是理解生命活动的基础。 蛋白质相互作用研究方法 一、酵母双杂交技术 二、免疫共沉淀技术 三、细胞共定位技术 四、GST Pull-down技术 五、FRET（荧光共振能量转移技术） 六、BiFC（双分子荧光互补技术） 七、TAP（串联亲和纯化技术） 八、Far-Western blot（亲和印迹技术） 一、酵母双杂交技术 1. 基本概述 2. 基本过程 3. 应用与优缺点 基本概述 酵母双杂交系统( Yeast two-hybrid system,Y2H)是1989年由Fields等提出并初步建立的,主要用于研究真核生物的蛋白质。 该系统利用了酵母的转录激活因子GAL4，含有的两个结构域，DNA结合域(DNA binding domain,BD)及转录激活域(activation domain,AD)，将已知基因（诱饵基因）和靶基因分别构建在含BD及AD质粒载体上，将两种质粒共同转化酵母感受态细胞，若BD结合的诱饵蛋白能够与AD结合的靶蛋白或文库中的某些cDNA编码的蛋白相互作用、彼此间结合时，则会导致位于侧翼的BD与AD在空间上接近，呈现GAL4转录因子的完全活性，激活下游的报告基因表达，从而在特定的选择性培养基上生长。 原理示意图 His3是编码组氨酸合成的基因，３-AT是它的竞争性抑制剂； ADE2是编码腺苷酸合成酶的基因。 lacZ是编码β-半乳糖苷酶的基因，可以用β-半乳糖实验测定活性。 MEL1编码α-半乳糖苷酶，可以降解X-α-Gal，产生蓝色。 GAL1, GAL2和 MEL1 的上游激活序列(UAS)应答于GAL4转录激活因子。 AH109衍生于 PJ69-2A菌株，包括ADE2,HIS3营养标记和一个内源的MEL1基因，lacZ 报告基因被引入PJ69-2A而得到AH109菌株。 基本过程 / ATGGCGTCTT?ACCAGAACCG?TCCAGGAGGT?CAGGCCACTG?ACGAGTACGG?AAACCCGATC?CAGCAGCAGT?ATGACGAGTA?CGGAAATCCG?ATGGGAGGAG?GAGGATACGG?AACTGGTGGT?GGTGGAGGAG?CTACAGGTGG?CCAAGGATAC?GGAACAGGTG?GCCAAGGGTA?CGGATCAGGT?GGCCAAGGGT?ACGGAACCGG?TGGCCAAGGA?TACGGAACCG?GGACCGGGAC?TGAAGGCTTT?GGAACTGGCGGAGGAGCTAG?GCACCACGGC?CAAGAGCAAC?TCCACAAGGA?AAGTGGTGGTGGCTTGGGAG?GAATGCTTCA?CCGCTCCGGA?TCTGGATCCA?GCTCTAGCTC?GGAGGATGAT?GGACAAGGAG?GGAGGAGGAA?GAAGGGAATA?ACACAAAAGA?TCAAGGAGAA?GTTGCCAGGT?CATCATGATC?AGTCTGGTCA?AGCTCAAGCG?ATGGGCGGCA?TGGGATCCGG?ATATGATGCT?GGTGGCTACG?GTGGTGAGCA?CCACGAGAAG?AAGGGGATGA?TGGACAAGAT?CAAGGAAAAG?CTTCCCGGTG?GTGGCCGTTA?A 应用 发现新的相互作用蛋白质 鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用 建立基因组蛋白连锁图 优点 1. 快速获得相互作用蛋白质的基因； 2. 检测在真核活细胞内进行，在一定程度上代表细胞内的真实情况； 3. 作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤； 4. 检测的结果可以是基因表达产物的累积效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用； 缺点 1. 分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工，如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行； 2. 有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。 二、免疫共沉淀技术 1. 基本概述 2. 基本过程 3. 优缺点 基本概述 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的、用于研究蛋白质相互