分子磷光和荧光课件资料.ppt

3. 化学与生物发光分析的应用 （1） 该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+ 、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等 （2） 可检测低至 10-9 mol/L 的H2O2； （3） 间接测定某些生物试样 氨基酸 + O2 ????? 酮酸 +NH3 + H2O2 氨基酸氧化酶 葡萄糖 + O2 + H2O ????? 葡萄糖酸 + H2O2 通过测定生成的H2O2 ，确定氨基酸、葡萄糖含量。 葡萄糖氧化酶 草酸二酯(能量提供体)+高浓度双氧水+稠环芳烃(能量接受体)+金属离子+溶剂组成的反应体系，可发出很强的可见光，发光效率高，使用不同的稠环芳烃，发射出不同颜色的光(冷光源)。 生物发光分析应用 1 在pH 7～8；荧光素酶(E)和Mg2+的存在下，荧光素(LH2)与磷酸三腺甙(ATP)的反应，生成磷酸腺甙(AMP)荧光素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐(ppi)： ATP + LH2 + E + Mg2+ ????AMP· LH2 · E +Mg ppi + 2H+ pH7 - 8 复合物与氧反应，产生化学发光： AMP· LH2 · E + O2 ???[氧化荧光素]* + AMP+CO2 + H2O [氧化荧光素]* ??? 氧化荧光素 + h? 最大发射波长562 nm； 生物发光分析应用 2 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在细菌中的黄素酶作用下，在氧化型黄素单核苷酸(FMA)存在下，发生发光反应 ： NADH + FMA + H+ ?????? NAD+ + FMNH2 NADH脱氢酶 FMNH2 + RCHO + O2 ???? FMN + RCOOH + H2O + h? 黄素酶 最大发射波长495 nm； 二、特点 characteristics 1. 灵敏度极高 例：荧光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化学发光分析，可测定2?10-17。Mol/L的ATP，即可检测出一个细菌中的ATP含量 2. 仪器设备简单 不需要光源、单色器和背景校正； 3. 发射光强度测量无干扰 无背景光、散射光等干扰； 4. 线性范围宽 5. 分析速度快 缺点：可供发光用的试剂少；发光反应效率低（大大低于生物体中的发光）；机理研究少。 三、装置与技术 instrument and technology 装置流程： 发光反应室 光检测器 信号放大器 显示与记录 发光反应可采用静态或流动注射的方式进行： 静态方式：用注射器分别将试剂加入到反应器中混合， 测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差； 流动注射方式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大； 作业： 简述紫外可见和荧光分光光度计有何异同？ 什么是荧光的激发光谱？什么是荧光的发射光谱？ 200 250 300 350 400 450 500 荧光激发光谱 荧光发射光谱 nm 蒽的激发光谱和荧光光谱 三、荧光的产生与分子结构的关系 relation between fluorescence and molecular structure 1.分子产生荧光必须具备的条件 （1）具有合适的结构：分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构, 才能吸收激发光； （2）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率也叫荧光效率或量子效率，它表示物质发射荧光的能力，通常用下式表示 荧光量子产率（?）： 在产生荧光的过程中，涉及到许多辐射和无辐射跃迁过程，如荧光发射、内转移、系间跨跃和外转移等。因此，荧光的量子产率，将与上述每一个过程的速率常数有关。 如外转换过程速度快，不出现荧光发射。 2 .化合物的结构与荧光 (1)跃迁类型 对于大多数荧光物质，首先经历????或n(非键电子轨道)???激发，然后经过振动弛豫或其它无辐射跃迁，再发生????或???n跃迁而得到荧光。 ????跃迁常能发出较强的荧光(较大的量子产率)。这是由于????跃迁具有较大的摩尔吸光系数(一般比n???大100-1000倍)。 其次，????跃迁的寿命约为10-7—10-9s，比n???跃迁的寿命10-5—10-7s要短。在各种跃迁过程的竞争中，它是有利于发射荧光的。此外，在????跃迁过程中，通过系间跨跃至三重态的速率常数也较小，有利于荧光的产生。 S1?T1能级差较大，这也有利于荧光的发射。