第五章 基因克隆的载体系统2014.ppt

第五章 基因克隆的载体系统 概述 1、 载体（vector）概念 能将外源DNA分子携带进入宿主细胞,并进行复制或表达的工具称为载体。 用来进行基因组克隆、cDNA克隆或亚克隆的DNA分子。 按功能分为克隆载体和表达载体。 载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 2 载体的特点 能在宿主细胞内独立复制； 有选择标记，易于识别和筛选； 可插入一段较大的外源DNA分子而不影响自身复制； 有合适的限制性酶切位点 第一节 克隆载体 用于携带DNA片断进入宿主细胞进行复制或保存的载体称为克隆载体。  主要的克隆载体 质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 单链DNA噬菌体载体 噬菌粒载体 动物病毒 一、 质粒载体 （一）质粒一般生物学特性 １质粒的概念 质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子，并不是细菌生长所必需的，但可以赋予细菌某些抵御外界环境因素不利影响的能力。 质粒常见于原核细菌和真菌中 绝大多数的质粒是DNA型的(酵母的杀伤质粒是一种RNA) 质粒DNA的分子量范围：1 - 300 kb ２主要构型 SC构型 cccDNA OC构型 开环DNA L构型 线性DNA 3 质粒的基本特性 1）自主复制性复制起始区（replication origin) ：?通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区（整个遗传单位定义为复制子） 大肠杆菌中使用的大多数载体都带有一个来源于 pMB1 质粒或 ColE1 质粒的复制起始位点 （2）质粒的拷贝数 拷贝数:常指生长在标准培养基条件下,每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目. 根据质粒在寄主细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为 松弛型（relaxed control ） : 10~60copies,高拷贝 严紧型（strigent contorl） : 1~几个copies,低拷贝 （3）、质粒的不相容性（plasmids incompatibility)  在没有选择压力的情况下,两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一个寄主体系中稳定地共存的现象，称为质粒的不相容性. 在细胞的增殖过程中,其中必有一种会被逐渐地排斥掉,不相容性的质粒组成不相容性群. ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容 根据质粒DNA中是否含有接合转移基因分为 接合型质粒（能自我转移） ：又叫自我转移型质粒，除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞 非接合型质粒（不能自我转移） ： 带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞 （二）质粒载体的构建及类型 1、天然质粒用做克隆载体的局限性 2、质粒载体必须具备的基本条件 3、质粒载体的选择标记 4、不同类型的质粒载体 1、天然质粒用做克隆载体的局限性 天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数 低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷， 不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种 野生型质粒为基础进行人工构建 2、质粒载体必须具备的基本条件 具有复制起点 具有抗菌素抗性标记 具有若干限制性单一酶切位点(多克隆位点(mutiple cloning site简称MCS)。 具有较小的分子量和较高的拷贝数 3、质粒载体的选择标记 氨苄青霉素 ( Amp ) 氯霉素 ( Cml ) 卡那霉素 ( Kam ) 链霉素 ( Sm ) 四环素 ( Tet ) 筛选标记 蓝白斑筛选 插入失活 4、不同类型的质粒载体 高拷贝数的质粒载体 ( Col E1、pMB1):拷贝数1000-3000 扩增基因 低拷贝数的质粒载体 ( F因子、pSC101):来自pSC101 拷贝数小于10 表达某些毒性基因 失控的质粒载体 :一类温度敏感型复制控制质粒 插入失活型的质粒载体 :载体的克隆位点位于其某一个选择性标记基因内部。如pDF41、pDF42、pBR329 正选择的质粒载体:直接选择转化后的细胞.只有带有选择标记基因的转化菌细胞才能在选择培养基上生长，如pUR2、pTR262等 表达型质粒载体:在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应的蛋白质的克隆载体特称为表达