实验三_单向琼脂扩散实验报告范本.ppt

【实验目的与要求】 掌握单向琼脂扩散试验的原理、操作方法、 结果分析及临床应用 * * 临床免疫学实验指导 检验医学院 免疫学教研室 吴荣泉 实验二、 单向琼脂扩散试验 【实验原理】 将适量的抗体加入琼脂内制成免疫琼脂板，打孔，在孔中 加入待测抗原，抗原可向四周呈辐射状扩散，当抗原，抗体在比例适宜时形成白色沉淀环. 沉淀环直径与抗原含量成正比。 用标准抗血清和已知浓度的抗原（或国际参考品）制成标准 曲线。通过测定样品沉淀环直径大小，可从标准曲线中读出抗原的含量。 本试验主要用于检测标本中各种Ig、补体的含量等，具有高灵敏性，高特异性特点。 【试剂与器材】 1. 羊抗人IgG血清（兔抗人血清，购买） 2. 标准参考血清(标准IgG质控物，购买) 3. 待检人血清（IgG—抗原） 4. pH7.4 0.01M PBS缓冲液（或NS） 5. 琼脂粉（制备1%免疫盐水琼脂液） 6. 载玻片、打孔器、 37℃恒温箱、湿盒、 可调微量加样器等 用于制作 标准曲线 【操作注意事项】 1. 制备抗体琼脂板 琼脂温度必须严格控制，温度 太低琼脂会凝固，太高则会影响抗体的活性 2. 加样孔内的琼脂应挑干净，切不可损坏孔的边 缘，确保每孔的液面基本一致 3. 加样精确，不能逸出孔外，否则结果不好观察 4. 加样吸取不同每份标本均应更换塑料吸头 5. 检测过程中，标准曲线必须与样品同步操作 6. 孵育时间应控制在37℃，24-48小时，时间太短 或时间太长会影响沉淀线的形成和清晰度。 【标准曲线的制备】由实验教师 1. 购买标准已知浓度的 人血清（IgG—抗原） 购买标准羊抗人（兔抗人） 抗人IgG--抗体（抗血清） 2. 制备1%盐水免疫琼脂凝胶板（在反面一角做好标记） 取琼脂粉1.0g，加NS，100ml.混匀加热溶解成透明液体， 放56℃，加入标准抗血清1.0—1.5ml，混匀，制板 3. 制板，打孔，孔径3mm，孔距1.2-1.5cm，打5个孔。 4. 加样：在各孔分别加不同浓度稀释度人标准血清10μL 1∶10， 1∶20， 1∶40，1∶80， 1 :160. 稀释 100 mg , 50mg , 25mg , 12.5mg ，6.25mg. 浓度 5. 保温反应：将凝胶板放湿盒内，37℃反应24h,观察结果. 6. 用坐标纸制作标准曲线:以沉淀环直径（m m）为纵坐标; 以标准浓度的对数值（Lg）为横坐标绘制标准曲线. 标准曲线与样品测定结果（实物实拍） 测定样本： 病人血清（ 标本 1. 25mm， 标本 2. 20mm ） 标准曲线制备：标准抗原稀释4钟浓度，预温24h，沉淀环直径数据 ① 30 m m ② 25 m m ③ 20 m m ④ 15 m m 以沉淀环直径为纵坐标，以抗原标准浓度的对数值（Lg） 为横坐标绘制标准曲线，根据样本测得直径，查出结果。 沉 淀 环 直 径（毫米） 4 2 5 6 7 3 8 标准抗原稀释： 1 ：10， 1 ：20 ， 1 ：40， 1 ：80 ， 1 ：160 相当抗原浓度： 100mg 50mg 25mg 12.5mg 6.25mg/L 沉淀环直径： 7mm 6mm 5mm 4mm 3mm Lg值： 2.0 1.699 1.398 1.097 0.796 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 9 ● ● ● ● ● 【实验方法】 1. 制备1.0%免疫盐水琼脂液 取琼脂粉1.0g ，加入100ml. NS，混匀加热溶解。 加热时用玻棒不断轻轻搅拌，使成透明液体，放56℃， 加入 1 : 2 稀释的羊（兔）抗人血清1.25ml，混匀， 56℃保温备用。 2. 制板： 每2人制作1个凝胶板。 取清洁玻片一张，在背面一角处标记，用5ml或10ml 刻度吸管 ，每片缓慢滴加3.5 - 4.0ml琼脂液，待凝。 3. 打孔： 每玻片打孔两个，孔径3mm，孔距1.0-1.2cm，