脑源性神经营养因子前体对海马神经元发育的影响.docVIP

脑源性神经营养因子前体对海马神经元发育的影响 　　摘 要：目的：通过体外培养海马神经元，给予抗proBDNF血清，观察其对体外海马神经元发育及存活的影响。方法：取新生0～1h的SD大鼠海马组织，体外培养神经元，给予抗proBDNF羊血清处理进行形态学观察，通过细胞免疫组织化学方法观察。结果：体外培养的海马神经元生长有明显的阶段性。给予抗proBDNF处理后，其表达量与神经元生长状态、存活细胞数成正比。培养1d组的表达水平高于3d、7d组，差值具有统计学意义。结论：给予外源性抗proBDNF羊血清处理后，体外培养的海马神经元生长状态良好且突起数目增多，提示内源性的proBDNF抑制神经元的发育，促进凋亡，给予外源性抗体后，减弱其生物学作用，神经元发育抑制因素减弱，存活细胞数、突起数增多。 　　关键词：海马神经元 proBDNF p75NTR sortilin 　　中图分类号：R651 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2015）05（b）-0241-02 　　神经元的发育对神经网络的形成及信号的传导等神经系统功能的执行非常关键。在神经元发育过程中，细胞的生存、生长、迁移、与其他细胞建立功能性联系，以及神经再生过程中轴突的生长等，除了受内源性程序的调控，还受到局部环境因素的影响。例如脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）。 　　BDNF是一类多肽，通过促进神经细胞的增殖、分化及存活而影响海马的神经发生，与活动依赖性突触可塑性有关，在学习与记忆过程中发挥重要作用[1]。外源性BDNF还可以促进体外培养的新生鼠海马颗粒细胞（DGCs）的存活及分化。与体内其他蛋白质的合成和分泌一样，脑源性神经营养因子由分子量为30-35kDa的前体物质--脑源性神经营养因子前体（precursor of brain derived neurotrophic factor， proBDNF）蛋白水解而来。传统的观点认为这些神经营养因子前体是无活性的，但2001年，Lee等首次发现神经营养因子前体可以促进细胞凋亡[1]。此后进一步的研究表明，proBDNF可能有着与BDNF相反的功能，Teng等发现proBDNF能够促进体外培养的神经元凋亡。 　　1 方法 　　1.1 海马神经元的培养 　　取新生0-1h的SD大鼠，在细胞培养间取出两大脑半球，制成细胞悬液，静置后取上层悬液，进行计数后按照实验要求以1×105/mL密度接种于包被好的培养板或玻片上。37℃、5%CO2恒温培养箱培养。以后根据细胞的生长情况及实验要求，在倒置显微镜下观察细胞的形态和生长情况。 　　1.2 分组 　　将培养的神经元随机分为抗proBDNF羊血清处理组、羊血清对照组及正常未处理组。各组选取1d、3d、7d三个时间点进行观察（给予干预组以加干预为0d计算）。 　　1.3 神经元鉴定 　　选取3d的细胞进行鉴定，倒置相差显微镜下观察、拍照、计数。根据公式计算出神经元纯度：[NeuN阳性细胞数/着色细胞数（总细胞数）]×100%=神经元阳性率（即神经元纯度）。 　　1.4 数据收集 　　根据实验要求选取不同时间点、不同条件的细胞，在倒置相差显微镜下观察。用于免疫组化的细胞显色后于镜下观察。 　　1.5 统计学处理 　　应用SPSS17.0统计软件包，数据均采用均数±标准差（x±S）表示。组内比较用t检验，组间比较用单因素方差分析。凡P0.05，差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 体外培养海马神经元的生长情况 　　普通倒置光学显微镜下观察，接种0h，大多数细胞呈圆球型悬浮于培养基中，折光性较好，单个散在分布。接种12～24h贴壁后，神经元周围长出类似于伪足的包裹体，边界不整齐；培养3d，包裹体周围开始有一些向外生长的突起，其中一个突起较其它突起迅速生长延伸，发育成较长的轴突，其余几个短小的突起则形成树突，神经元之间逐渐形成网络；培养7d，轴突继续延伸，树突分支增多，神经元轴突和树突相互交叉、连接，形成复杂的网络。 　　2.2 处理组海马神经元的生长发育情况 　　体外培养的海马神经元，当1d组给予抗proBDNF与DMEM/F12以1：20比例稀释浓度处理时，所选取的处理组培养1d、3d、7d的细胞生长状态、存活细胞数明显多于阴性对照及正常对照组，且多突起神经元明显增多；浓度过高或过低都不利于神经元的生长。同时，当神经元形态稳定后也就是7d时给予抗proBDNF血清处理，无突起神经元出现空泡样变化。生长3d的神经元给予抗proBDNF处理后，细胞形态变化不明显，生长状态影响不大，组间差异无统计学意义。 　　3 讨论 　　3.1 新生大鼠海马神经元的体外原代培