第十一章生物技术在林木育种中的应用详细分析.ppt

5. 转基因植物的鉴定与外源基因表达的检测 由于转基因的目的是想通过外源基因在转化植株体内表达，来提高植株在这个方面的表达程度。特别是关于那些转入基因的目的是增加植株抗性的研究中，为了测定基因是否转入或者转入后是否表达，可以给转基因植株一定的选择压力，如果产生抗性，表明为转基因植株。 在转抗病基因的植物中，连续多年人工接种病菌，一直表现抗性的植株可以确定为转基因植株。 在转甜菜碱醛脱氢酶基因的植株，在含有NaCl的培养基和大田中筛选抗盐转基因植株等。 (5) 转基因植物的鉴定与外源基因表达的检测 大多数转基因植物的外源基因的表达都相当低，现在认为这是由于外源基因插入的位点效应引起的； 另外，外源基因的表达会受到植物体自身的同源基因或先前转入的外源基因中的同源序列的影响而常表现为外源基因失活。 外源基因导入植物细胞后，其表达与否及表达量的高低可通过三种方法进行检测。 其一是与标记基因和报告基因整合，通过两者的活性高低检测，即可知外源基因的表达水平。 其二是直接检测外源基因转录以及它的翻译产物的多少，这是目前最具说服力的检测方法。 其三是效果检测，如抗病毒基因工程中的攻毒试验、抗虫基因工程中的抗虫试验等。这是最直接、也是最后的检测方法，是某一种植物基因工程成功与否的最后判断标准。 2 基因工程技术在林木育种中的应用 （1）抗虫基因工程 （2）抗病基因工程 （3）抗旱和耐盐碱基因工程 （4）抗寒基因工程 （5)与木材改良有关的基因工程 （6)与开花发育、生根等有关的基因工程 （7）抗环境污染基因工程 （1）抗虫基因工程 虫害严重影响树木的生长和存活，甚至导致物种的消失和造林的失败。大面积人工林更加剧了虫害的蔓延，造成了毁灭性的森林灾害。因此，培育抗虫的树木新品种对人工林建设有重要意义。 自1987年比利时的Vacek等首次获得烟草Bt(苏云金杆菌内毒素基因)转基因植株以来，Bt基因已转入烟草、番茄、玉米、棉花、果树及林木等多种植物中，一些转Bt基因农作物已进入商品化生产。 （1）抗虫基因工程 我国是杨树抗虫基因工程研究较早的国家之一，目前获得的转基因杨树已相继进入大田试验及商业化阶段。 如中国林科院与中国科学院合作将Ｂt基因导入欧洲黑杨、欧美杨和美州黑杨，获得对舞毒蛾有毒杀作用的杨树转化再生植株，并进入商品化生产阶段。 河北农业大学将Bt基因和慈菇蛋白酶抑制剂基因构建在一个植物表达载体上，通过根癌农杆菌介导将此表达载体上的双基因转入白杨优良杂种741杨中，获得了对杨扇舟蛾、舞毒蛾、美国白蛾等鳞翅目害虫具高抗性的植株。转基因植株的幼虫死亡率达到80％以上，存活幼虫生长发育受到明显抑制，植株生长发育未受影响，现进入商品化生产阶段。 到目前为止，转Ｂt基因的树种有杨树、苹果、核桃、落叶松、花旗松、火炬松和云杉等。 （1）抗虫基因工程 转抗虫基因植株的应用可以产生抗虫效果，但存在的潜在问题也是明显的。 Bt毒蛋白仍存在杀虫谱带窄、毒力不够强的问题。 除了转基因植物的环境安全考虑外，害虫的耐受性是一个不容忽视的问题。 由于树木长期的生长过程中基因始终不变，而昆虫经过许多世代演化后，一旦对这种转基因树木产生抗性，转基因植株将失去其自身的价值。 （2）抗病基因工程 抗病基因根据其作用对象可分为：抗病毒基因、抗真菌基因和抗细菌基因。 在林业上，抗病毒基因工程研究起步较晚，目前使用的只有杨树花叶病毒外壳蛋白（PMV-CP）基因、洋李痘病毒的外壳蛋白（PPV）基因和黄瓜花叶病毒外壳蛋白（CMV-CP）基因等几种。 英国牛津大学的Cooper研究小组克隆了杨树花叶病毒外壳蛋白基因，将其转化杨树并获得成功。 Camara等（1995）把洋李痘病毒的外壳蛋白（PPV）基因分别导入李和杏中，获得了较好的抗PPV特性。 我国在这方面未见成功报道。 （2）抗病基因工程 林木抗真菌和细菌基因研究有一定的进展。目前克隆出抗真菌性病害的基因有几丁质酶基因（Chi）和角质酶基因（Cut），已构建了能在杨树细胞中表达的几丁质酶基因的表达系统。 2001年Liang等将来自小麦的草酸氧化酶基因导入杨树，提高了转基因植株的抗真菌能力。 我国已从兔子中成功地克隆了防御素NP-1基因，构建了植物表达载体，通过农杆菌介导法将该基因导入毛白杨，检测发现转基因植株组织提取液对枯草杆菌、农杆菌和立枯病原菌等多种微生物的生长均有不同程度的抑制作用。 （3）抗旱和耐盐碱基因工程 植物抗渗透胁迫是受多基因控制的复合遗传性状，与许多生理生化过程有关。能否对抗渗透胁迫特征进行遗传改良，关键在于能否找到限速代谢步骤以及克隆到限速酶的基因。 目前，已经从不同植物中克隆到谷氨酸合成脯氨酸代谢途径中的催化关键酶—吡咯啉 5 羧酸合成酶基因(P5CS)和胆碱合成甜菜碱的最后一个催化酶基因—甜菜碱醛