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细菌内毒素检查法在中药注射液中的应用与研究进展 　　摘要：目的：介绍中药注射液细菌内毒素检查法的应用和研究进展。方法：查阅相关文献，对细菌内毒素检查法以及中药注射液应用细菌内毒素检查药品质量的研究情况进行综合分析和归纳总结。结果：细菌内毒素检查法在中药注射液中的研究范围很广，成果很多，但是同一品种未形成统一的标准。结论：须加强中药注射液细菌内毒素检查法研究，形成统一的国家标准。 　　关键词：细菌内毒素 鲎试验法 中药注射液 　　细菌内毒素检查法又称鲎试验法（BET），是利用鲎血细胞的溶解物与微量细菌（主要是革兰氏阴性菌G—）的内毒素反应，从而检出被检测物质中内毒素的一种生物体外检测技术。该法操作简便与快捷、经济性好、灵敏度高、特异性强、重现性好，在化学药品的检测标准中普遍取代了传统的热原检查法。在现行的《中国药典》2010年版二部中收载了细菌内毒素检查的品种424个 [1]。 　　1 细菌内毒素检查法的国内发展简述 　　1956年，美国人Bang发现美洲鲎血液遇革兰氏阴性菌时会产生凝胶。其后，Levin和Bang研究发现微量革兰氏阴性菌产生的内毒素也可以引起凝胶反应，从而在1968年正式建立以鲎血液的提取物为检测试剂的鲎试验法[2]。1973年，美国食品药品管理局认可了鲎试剂，并在1980年首次正式收载于美国药典，作为法定的药品检查方法。随后，英国、德国、意大利和日本等国相继收载了此法。与国外相比，我国的细菌内毒素检查法起步晚，在这方面的研究相对落后一些。从发展的过程来看，大概可以分为三个阶段。第一阶段，萌芽期： 1983年，我国卫生部首次授权中国药品生物制品检定所组织全国范围的大输液及放射性药品的鲎试验检查方法[3]。随后，药学工作者加强了对细菌内毒素的研究，主要涉及细菌内毒素检查法的介绍以及方法的研究。直到1995年，《中国药典》正式收载鲎试验法。第二阶段，发展期：成为法定的检查方法后，很多药品建立了细菌内毒素检查法，但是基本上都是凝胶法，而动态浊度法等定量的检查方法很少。第三阶段，成熟期： 2003年，对细菌内毒素的定量检测开始在我国临床全面开展应用。其后，细菌内毒素的定量检查方法被广泛应用于各种药品的质量控制。在一段时期内，定量法的使用率超过了凝胶法，约占65%—70%[4]。 　　2 鲎试验法的实验方法级影响因素 　　2.1 实验方法 　　细菌内毒素检查法包括两种实验方法，即凝胶法和光度测定法。凝胶法是通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。它是各国药典细菌内毒素检查法的首选方法。中国药典中也明确规定，当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。光度测定法是利用分光光度法的原理来定量细菌内毒素的方法，包括浊度法和显色基质法。其中浊度法又分终点浊度法和动态浊度法；显色基质法又分终点显色基质法和动态显色基质法。 　　2.2 影响因素 　　工作中，我们经常发现这样的一些问题：阳性管不凝集、同一批检品进行多次细菌内毒检查时有时判为合格有时判为不合格、阴性管凝集等。其实这些问题的产生与实验的影响因素有关。第一是实验的环境的影响：实验室要求洁净，无尘埃空气流通，若是空调室，应备有一台超净工作台[5]，在整个操作过程中应防止微生物的污染，比如：汗液的污染、人员的口沫。第二是实验试剂的影响：细菌内毒素工作标准品本身效价的误差或效价不稳定、鲎试剂自身的灵敏度的改变和自身凝集时间以及成胶的状态的不符合要求、细菌内毒素检查用水的质量标准低[6]。第三是供试品中相关成分的影响，比如：能激活鲎试剂旁路的多糖物质很容易产生阳性结果[7]、能够和细菌内毒素形成复合物的蛋白质能产生显著的屏蔽作用[8]、易引起细菌内毒素聚集，加重低浓度细菌内毒素不易散的高离子强度的离子[9]等等。第四是反应条件的影响，比如：保温时间的延长会提高鲎试剂的灵敏度[10]、温度对鲎试剂的灵敏度有显著的影响，在达到48℃时鲎试剂会遭到破坏[10]、过高的pH和过低的pH会对鲎试剂的反应产生抑制作用[11]。第五是实验器具的影响，稀释用刻度吸管应经过校正，玻璃管应是硬质的玻璃管，若使用聚丙烯塑料管可能会干扰结果[12]。第六是实际操作的影响，比如鲎试剂的安剖瓶开启是应注意瓶外壁的脏物和砂轮的碎屑、鲎试剂溶解时避免用力振摇产生的气泡等等。 　　3中药注射液细菌内毒素检查法的现状 　　相同，但是检查注射液中内毒素的方法都是热原试验法。作为我国特有的一种剂型，中药注射液的细菌内毒素检查法虽在企业标准中有收载，但在《中国药典》2010年版一部和部颁标准等标准中未有收载。 　　3.2 中药注射液细菌内毒检查法的研究现状 　　自细菌内毒素检查法收载于中国药典附录以来，化学药品、放射性药品和中药药品的细菌内毒素的研究从未间断。基本上