荧光光谱法测定水样中维生素B6的含量标准实验报告.docVIP

F-4500荧光光谱仪测定水样中维生素B6的含量 一、实验目的 学习和掌握荧光光度分析法测定维生素B6的基本原理和方法。 学习选择荧光激发和发射波长的方法。 掌握F-4500荧光光谱仪的使用方法。 二、方法原理 1. 分子荧光的产生 物质在吸收入射光的过程中，光子的能量传递给了物质分子。分子被激发后，发生了电子从较低的能级到较高能级的跃迁。这一跃迁过程经历的时间约10-15s。跃迁所涉及的两个能级间的能量差，等于所吸收光子的能量。紫外、可见光区的光子能量较高，足以引起分子中的电子发生电子能级间的跃迁。处于这种激发状态的分子，称为电子激发态分子。 电子激发态的多重态用2S+1表示，S为电子自旋角动量量子数的代数和，其数值为0或1。分子中同一轨道里所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自旋配对。假如分子中的全部电子都是自旋配对的，即S=0，该分子偏处于单重态，用符号S表示。大多数有机物分子的基态是处于单重态的。倘若分子吸收能量后电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化，这时分子处于激发的单重态；如果分子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变，这时分子便具有两个自旋不配对的电子，即S=1，分子处于激发的是三重态（或称三线态），用符号T表示。符号S0、S1、S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发单重态，T1、T2分别表示第一和第二电子激发三重态。 处于激发态的分子不稳定，它可能通过辐射跃迁和非辐射跃迁的衰变过程而返回基态。辐射跃迁的衰变过程伴随着光子的发射，即产生荧光或磷光；非辐射跃迁的衰变过程，包括振动弛豫、内转化和系间窜跃，这些衰变过程导致激发能转化为热能传递给介质。 2. 同一物质而言，荧光强度F与该物质的浓度C有以下关系: F=2.303YfI0(bc，其中Yf为量子荧光产率，I0入射的光强度，(是摩尔吸光系数，b是比色皿的厚度，C为所测物质的浓度。当0.05((bc时，则荧光强度和溶液的浓度呈线性关系，即 F=KC 即在较低的浓度情况下，荧光强度与该物质的浓度C呈线性关系。 三、仪器和药品 F-4500荧光光谱仪、移液管、洗耳球、烧杯、天平、维生素B6、Na2HPO4、柠檬酸、蒸馏水等 四、实验步骤 1. 标准系列溶液的配制 100 ug/mL维生素B6标准溶液：准确称取0.1g维生素B6溶解定容于100ml容量瓶。准确移取10ml该溶液稀释至100ml。 在五个干净的50ml容量瓶中，依次移入0.1ml，0.2 ml，0.3ml，0.4ml，0.5ml浓度为100ug/mL维生素B6标准溶液，并分别移入pH=7.0的缓冲溶液2.50 ml，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。 2. PH＝7.0 Na2HPO4-柠檬酸缓冲液 取Na2HPO417.9g溶于烧杯后移入250ml容量瓶，稀释至刻度，摇匀，即成0.2mol/LNa2HPO4溶液。 取柠檬酸2.1g溶于烧杯后，移入100ml容量瓶，稀释至刻度，摇匀，即成 0.1mol/L柠檬酸溶液。 将Na2HPO4与柠檬酸溶液按6:1的体积比配成缓冲溶液250ml。 3.选择维生素B6荧光光谱 4.F-4500荧光光谱仪的使用 开机 ①开启主机[power](在左下方)，确定散热风扇运转是否正常。 ②按[Xe Lamp]键(按下时间勿超过5秒)。检查Xe Lamp指示灯是否已亮，如每辆，需等10S后再按一次。 ③开启[MAIN]键,此时，RUN指示灯会闪一下。 ④开启计算机 ⑤开启软件即可开始操作。 软件操作步骤 ①点击桌面的，打开操作软件。 ②参数的设置： ③将配制好的样品装入比色皿中，垂直放入样品槽中。 将激发狭缝和发射狭缝分别设置为5nm和5nm，扫描速度设置为1200nm/min。用一号溶液，以=390 nm为发射波长，在260~360 nm波长范围内扫描激发光谱，找出最大激发波长；以=326nm为激发波长，在350~450nm范围内扫描荧光光谱，找出最大发射波长。 4. 标准溶液的测定 设置适当的仪器参数（最大激发波长=326nm，最大发射波长=390 nm）测量标准系列溶液的荧光强度。 5. 未知试样的测定 取未知液与标准工作曲线相同的条件，测量试样的荧光强度。 五、数据记录及结果处理 用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线如图。 根据经稀释的待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度。 六、思考题 什么是瑞利散射？瑞利散射如何消除？ 入射光在线度小于光波长的微粒上散射后散射光和入射光波长相同的现象。由英国物理学家瑞利提出而得名。1871年，瑞利在经过反复研究，反复计算的基础上，提出了著名的瑞利散射公式，当光线入射到不均匀的介质中，如乳状液、胶体溶液等，介质就因折射率不均匀而产生散射