蛋白质与酶工程第四章酶分子修饰详解.ppt

形成基因文库 突变文库的组装是将重组DNA转入受体细胞或包装成有感染活性的重组噬菌体的过程。 大肠杆菌转化技术 （二）突变基因的筛选 1 定向选择环境条件的设定 根据定向进化的设定选择环境 在每一次“突变——筛选”的循环中加以调整选择环境 （1）提高酶的热稳定性： 较高温度下培养重组细胞，每次循环提高温度。 （2）提高β-内酰胺酶的催化效率： 一定浓度的β-内酰胺类抗生素中培养，每次提高浓度 2 高通量筛选技术 平板筛选法 荧光筛选法 噬菌体表面展示法 细胞表面展示法 核糖体表面展示法 平板筛选法 平板筛选方法是将含有随机突变基因的重组细胞，涂布在平板培养基上，在一定条件下培养，依据重组菌细胞的表型鉴定出有效突变基因的筛选方法。 特点： 简便、快速、直观、容易控制和调整环境条件 依据： 重组细胞的表型 细胞生长情况 颜色变化情况 透明圈情况 （1）依据细胞生长情况筛选突变基因 热稳定性：温度梯度和高温环境 抗生素耐受性：抗生素浓度梯度 pH稳定性： pH梯度 极端环境：高盐、低温、高浓毒物质 （2）依据颜色变化筛选突变基因 反应产物显色 蓝白斑筛选（Blue white screening）： 诱导物：IPTG 底物：X-gal */138 磷酸酯酶水解硝基酚磷酸生成黄色硝基酚； */138 Homogenized activated sludge sample cultured on 1/10-strength LB plates amended with CPQP and viewed with (A) white light and (B) fluorescent light revealing colony with halo (arrow 1) and no halo (arrow 2). （3）依据透明圈情况筛选突变基因 依据透明圈情况筛选突变基因是在平板培养基中加入目的酶的作用底物，然后接种重组细胞，在一定条件下进行培养，培养一段时间后，在一些重组细胞的菌落周围会出现较大的透明圈。 豆豉纤溶酶（douchi fiberolytic enzyme，DFE） 血纤维蛋白平板（blood agar） 荧光筛选法 噬菌体表面展示法 细胞表面展示法 核糖体表面展示法 某些酶定向进化结果 */138 目标酶 所需功能 方法 结果 实施菌种 卡那霉素核苷基转移酶 热稳定性 定位诱变+选择 在60-50℃酶半衰期增加200倍 耐热脂肪芽孢杆菌 枯草杆菌蛋白酶 作用于有机溶剂 易错PCR+选择 在60％二甲基亚砜中活力增强170倍 枯草杆菌 β-内酰胺酶 作用于新底物 DNA改组+选择 对cefotaxime的抗性增加32000倍 大肠杆菌 对硝基苯酯酶 有机溶剂中的底物特异性和活性 易错PCR+重组 活力增加60-150倍 大肠杆菌 胸苷激酶 第五特异性 基因理疗 交错延伸+选择 活力增加43倍 大肠杆菌 β-半乳糖苷酶 底物特异性 DNA改组+选择 活力增加66倍底物特异性增加1000倍 大肠杆菌 砷酸脱毒途径 砷酸抗性 DNA改组+选择 抗性增加12倍 大肠杆菌 1、提高酶的催化活性 是定向进化的主要目标之一 例如： 1993年陈等人提高枯草杆菌蛋白酶E在有机溶剂中的催化效率（157倍） 1994年Stermer使β-内酰胺酶催化活性提高32000倍 1992年Beaudry等使四膜虫RNA剪切酶提高100倍 */138 五 酶定向进化的应用 2、增强酶的稳定性 提高酶稳定性的方法： 分子修饰 固定化 非水相介质催化 定向进化 */138 3、改变酶的底物特异性 影响酶对底物的Km值，进而改变底物特异性 例如： 2000年，Aharoni等采用基因家族重排技术将大肠杆菌碱性磷酸酶对有机磷酸酯的特异性提高2000倍 2005年，冯志勇等采用易错PCR技术使β-糖苷酶失去原有的催化糖苷水解的活性，而呈现糖基转移酶的活性 2002年，Bartel使RNA剪切酶失去催化RNA分子剪切反应的特性，而呈现出将RNA和多肽链拼接在一起的催化特性。 */138 */138 二、基本原理 合理设计与非合理设计： 在比较充分了解酶的结构和功能的基础上对酶分子进行改造，称为合理设计； 不需要准确的酶分子结构信息，通过随机突变，基因重组，定向筛选等方法对其进行改造，称为酶分子的非合理设计。 基本技术手段：易错PCR，DNA重组，高突变菌株等技术。 酶的合理设计 实验室定向进化示意图 随机突变+定向选择＝目标突变体 细菌 诱发突变的因素 50 0C培养 突变体库 选择压力（温度） 温度耐受型突变体 最适生长温度为370C 最适生长温度提高了！ 体外定向进化的意义 理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这