荧光探针简介.ppt

荧光探针在检测生物体中金属离子方面的应用 有机化学 生物体中的金属元素 Na、K 维持细胞两侧渗透压、形成神经冲动； Ca 抑制脑神经的异常兴奋，使人保持镇静； Zn 对大脑的记忆与思维过程有重要影响； 金属蛋白 (1)含铁蛋白。如血红蛋白、细胞色素C等，前者具有载氧、释氧功能，细胞色素C是电子传递体。 (2) 含铜蛋白。如血浆蓝铜蛋白和质蓝体，前者参与机体内铜的调节，后者是生物过程中的电子传递体。 (3)铁硫蛋白。是一类含铁、硫的天然原子簇化合物与蛋白质链上半胱氨酸结合的金属蛋白，如细菌铁氧还蛋白含Fe4S4原子簇，它是生物体中重要电子传递体。 (4)金属酶。具有催化生物体内化学反应的金属蛋白，常常金属离子位于活性中心，如锌酶。 20世纪60年代以来，随着配位化学、生物化学、分析化学等多个学科的发展，出现了一门新的交叉学科——生物无机化学。其研究对象是生物体内的金属（和少数非金属）元素及其化合物，特别是痕量金属元素和生物大分子配体形成的生物配合物，如各种金属酶、金属蛋白等。侧重研究它们的结构-性质-生物活性之间的关系以及在生命环境内参与反应的机理。 生物体中参与代谢过程的金属离子，往往以游离态和配合物的形式存在； 因此，其金属离子的浓度及其分布情况就成为十分关键的热力学和动力学参数。 如何检测生物体内离子的浓度和分布？ 例如，细胞内Ca2+等的检测： 1）核磁共振波谱法； 2）化学修饰电极（电化学探针）； 3）发光蛋白法； 4）荧光探针方法（最常用）。 引自：科学技术与工程，2004，4（11），948~953 荧光探针法 利用某种能与特定目标分子或离子特异性结合，且复合后荧光光谱发生显著变化的探针分子，对细胞样品进行染色，然后在紫外光照射下发射荧光，从而通过显微镜直接观察和测量得到金属离子浓度和分布等信息的方法。 配体与Ca2+络合后，荧光显著增强 引自：Angew.Chem.Int.Ed.,2007,46,7445 荧光探针方法的优点 灵敏度高（一般用量10-4~10-5mol/L）； 选择性好； 可用显微镜直接观察，时空分辨率很高； 响应时间短； 操作方便、成本低； ?????? 测定神经细胞中的Ca2+ 引自：Angew.Chem.Int.Ed.,2007,46,7445 怎样设计荧光探针？ 基本要点： 荧光探针分子由识别基团和荧光团两部分键合而成； 依据一定的原理进行设计，使探针分子与目标物结合前后的荧光光谱有显著区别。 识别基团 螯合剂类 超分子配体 荧光团 荧光增强： 1、分子中含有较大的共轭体系； 2、分子结构较好的平面性和刚性； 3、含有与共轭体系直接相连的供电子基团。 荧光减弱： 1、仅含与共轭体系直接相连的吸电子基团； 2、含有可导致荧光猝灭的基团。 如何使探针与客体结合前后发生荧光光谱的显著变化？ 1）光诱导电子转移机理（PET）； 2）光诱导电荷转移机理（PCT）； 3）荧光共振能量转移机理（FRET）； 4）基于其它原理的设计。 光诱导电子转移机理（PET） 荧光探针与Ca2+结合后荧光增强 引自：Angew.Chem.Int.Ed.,2007,46,7445 与结合后，电子供体的HOMO能级下降，从而供电子能力降低。荧光猝灭消失。 电子供体的基态能级高度处于荧光团的HOMO和LUMO之间。从而，荧光团被激发后，供体电子转移到荧光团的HOMO轨道上，使LUMO轨道上的电子无法通过辐射驰豫回到基态，从而使荧光猝灭。 与Ca2+结合前发生光诱导电子转移（PET），无荧光发射。 正常发出荧光 注意分子结构特点：荧光团与猝灭基团之间一般以非共轭基团相连。 光诱导电荷转移机理（PCT） 识别基团与Zn2+结合后，造成与稠杂环相连的N原子的供电子能力下降，减弱了光诱导电荷转移，从而荧光强度降低，荧光光谱蓝移。 当直接连有供电子基的荧光团和吸电子基共扼连接时，在光的激发下，分子内就会发生从电子供体到电子受体的电荷转移。此即光诱导电荷转移（PCT）。 PCT效应可以使分子的荧光增强并且光谱红移。 引自：J.Am.Chem.Soc.,2002,124 (36),10650 荧光共振能量转移机理（FRET） 以485nm做激发波长时，加入Zn2+前，该分子在518nm附近显示荧光素基团的特征发射；而当加入 Zn2+后，发射峰红移至罗丹明基团的特征发射峰（590nm）。 引自：Anal.Chem.,2010,82,3108 荧光共振能量转移（PRET）是指在两个不同的荧光团中，如果一个荧光团(供体)的发射光谱与另一个荧光团(受体)的吸收光谱有一定的重叠，则当这两个荧光团间的距离较近时(一般小于10nm)，就可以观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即用供体的激发波长激发时，可观察到受体的荧光发射。 Z