荧光定量PCR实验技术干货.ppt

质粒标准品稀释方法 * 倍比梯度稀释方法： 1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii 1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv 1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v * 绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量 * 方法：检测毕赤酵母的A基因 标准品：质粒标准品浓度为5个浓度；3个重复；设阴性空白对照 实验步骤： 提取A DNA； 设计特异引物； 设计TaqMan探针并标记探针； 荧光定量扩增； 结果分析：获取毕赤酵母的A的精确copy数。 * 绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量 * Sample copies/ml Ct1 Ct3 Ct2 Mean Ct STD 标准品 1.41×105 22.33 22.20 22.46 22.33 0.13 标准品 1.41×106 18.70 18.32 18.61 18.54 0.20 标准品 1.41×107 15.09 15.15 15.37 15.20 0.19 标准品 1.41×108 11.78 11.98 11.62 11.79 0.18 标准品 1.41×109 8.30 8.35 8.26 8.30 0.046 未知样品 ? 18.44 18.47 18.44 18.45 0.024 空白对照 None None * 绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量 * 扩增效率（E）计算 E =10-1/斜率 -1 =10-1/-3.481 -1 =1.983-1 =0.938 标准曲线制作：利用Mean Ct 作图可得到标准曲线 y = -3.481x + 40.123 R2 = 0.9996 相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。 扩增效率（E）：0.8-1.2, 越接近1，越理想。 * 绝对定量实验例－－毕赤酵母A基因的绝对定量 * 未知样品拷贝数的计算 将Ct值带入线性方程： 18.45= -3.481 X +40.123 QuantityUnknown=10 6.226 =1682674 copies X= 18.45-40.123 -3.481 =6.226 * 相对定量的必要性 * Sample B Sample A 目的基因扩增效率相同 RNA提取效率相同 细胞起始数相同 实际目的基因表达量分析 * 相对定量分析方法 * 比较两个或两个以上样本中某个基因表达量的变化！ 关注点：基因的相对表达量，而不是基因的绝对量！ * 相对定量分析几要素 * 一个参照样本 一个或一个以上的未知样本 一个目的基因 管家基因——用来校对不同样本之间目的基因的实际表达量 重复反应孔——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性 标记方法的选择——SYBR Green法或探针法均可 实验结果显示——扩增曲线；标准曲线（有些分析方法不需要）；融解曲线（探针法不需要） 一组标准样本（有些分析方法不需要） * 相对定量分析－－管家基因筛选 * 管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因， 如：GAPDH、Actin、18S rRNA等 筛选方法 根据文献提供 通过具体实验筛选 0 1 2 3 4 5 6 Sample1 Sample2 Sample3 Sample4 实验组 实验值 β-Actin GAPDH β-2-microglobulin HPRT P P P O * Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. 荧光定量PCR技术及数据处理分析 项目部 内容概要 荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR解析方法 荧光定量实验流程 荧光定量PCR仪 生工荧光定量产品选择指南 * 荧光定量PCR原理－－定义 实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，对起始模板进行定量分析 与常规 PCR技术比较： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测 * 荧光定量PCR原理－－标记方法 * SYBR Green I * TaqMan Probe 分子信标 SYBR Green I 染料法－－S