Nothch1与非小细胞肺癌上皮间质转化关系初探.docVIP

Nothch1与非小细胞肺癌上皮间质转化关系初探 　　【摘要】 目的 研究Nothch1与非小细胞肺癌上皮间质转化（EMT）关系。方法 采用免疫组化法和RT-PCR法对我院40例非小细胞肺癌患者的Notch1，E-cadherin和Vimentin蛋白和mRNA的表达情况进行检测，并分析其相关性。结果 Notch1在EMT（+）组的阳性表达率明显高于EMT（-）组，两者在NSCLC组织中表达具有相关性。结论 Notch1可能参与了NSCLC患者的EMT过程，阻断Notch信号通路可能会抑制NSCLC患者的EMT过程。 　　【关键词】 上皮间质转化；非小细胞肺癌；Notch1 　　Notch1是Notch基因编码的4种受体之一，Notch信号通路和肿瘤发生有密切关系。为研究研究Nothch1与非小细胞肺癌上皮间质转化（EMT）关系，本文采用免疫组织化学技术和RT-PCR方法对非小细胞肺癌患者的Notch1指标和EMT标志物E-cadherin，Vimentin水平进行检测，分析Notch1与EMT的相关性。 　　1 材料和方法 　　1.1 一般资料 以2008年5月至2009年4月青岛大学医学院附属医院胸外科40例非小细胞肺癌（NSCLC）行肺切除患者标本为研究对象，并以20例正常肺组织为对照。40例NSCLC患者中，男性患者26例，女性患者14例，年龄42-74岁，其中鳞癌患者27例，腺癌患者13例，16例患者有淋巴结转移，24例患者无淋巴结转移，患者中Ⅰ期14例，Ⅱ期15例，Ⅲ期11例。 　　1.2 仪器和试剂 　　1.2.1 主要仪器 水浴箱，紫外分光光度计，PCR仪。 　　1.2.2 主要试剂 鼠抗人Notch1单克隆抗体（1：50）（来源：OriGene生物科技有限公司）；鼠抗人上皮性钙粘附蛋白单克隆抗体工作液（来源北京中杉公司）；vimtemin单克隆抗体工作液、二抗PV 6000，显色剂二氨基联苯氨（DAB）试剂盒（来源：北京中杉生物工程公司）；RNA提取试剂盒（来源：TaKaRa公司），逆转录试剂盒及PCR试剂盒（来源：Fermentas中国公司）。 　　1.3 检测方法 　　1.3.1 免疫组化检测 ①对石蜡标本进行4μm厚连续切片；②放置于60℃烤箱过夜；③采用二甲苯进行脱蜡2次，每次5分钟；④采用梯度酒精水化，并采用蒸馏水进行冲洗；⑤采用3%过氧化氢去离子水孵育10分钟；⑥采用蒸馏水进行冲洗，并使用EDTA微波热修复，维持10分钟；⑦自然冷却至室温后，采用PBS冲洗4次，每次1.5分钟；⑧滴加一抗，并在37℃孵育，维持60分钟；⑨采用PBS进行冲洗4次，每次1.5分钟，并滴加PV 6000工作液；⑩在37℃湿盒内进行孵育，持续20分钟；○11采用PBS冲洗4次，每次1.5分钟；○12采用DAB进行显色，并采用自来水进行冲洗；○13复染，脱水，透明，封片。 　　1.3.2 RT-PCR检测 ①取冻存的新鲜肺组织100mg，加入Trizol提取液lml，研磨直至粉末状，提取总RNA。②取5μl总RNA，采用2%琼脂糖凝胶电泳对其完整性进行分析。③采用紫外分光光度计对总RNA A260nm和A280nm波长处吸光值进行分析，检测纯度和浓度。④进行逆转录和PCR扩增反应。 　　1.4 判断指标 对Notch1，E-cadherin和Vimentin蛋白的表达及其相关性进行评价和分析。 　　1.5 统计学分析 采用SPSSl7.0统计软件进行统计学分析。 　　2 结 果 　　2.1 免疫组化法检测Notch1，E-cadherin和Vimentin蛋白的表达情况 Notch1，E-cadherin和Vimentin蛋白在NSCLC和癌旁正常肺组织中的表达，见表1。 　　3 讨 论 　　EMT在胚胎发育过程中重要的因素，研究表明，恶性肿瘤细胞在向周围组织侵袭和向远处器官转移的过程中，EMT现象也普遍存在。肿瘤细胞转移是一个连续的过程，上皮源性肿瘤细胞通过EMT过程，会导致极性丧失，进而导致细胞形态发生改变，增加其迁移能力。在这一过程中，会出现E-cardherin等上皮特征分子表达减少的现象，而vimentin等分子表达则增加。因此，对E-cardherin和vimentin分子的监测能够反映EMT情况。 　　肿瘤细胞发生EMT现象主要过程如下，首先出现“钙粘蛋白转换”，并出现E-cadheri表达下调和N-cadherin表达增加现象，而正常上皮细胞和细胞间的黏附性则出现下降。研究表明，在肿瘤细胞中，EMT现象能够为研究肿瘤发病机制提供参考，也为肿瘤的诊断和治疗提供了新的思路。 　　有证据显示，在NSCLC组织中，Notch1与EMT过程相关，显示Notch1参与了NSC