格列喹酮促进C2C12细胞摄取葡萄糖.docVIP

格列喹酮促进C2C12细胞摄取葡萄糖 时间:2010-05-13 来源:应届毕业生网 点击: 127次 摘要：1 引言 胰岛素抵抗和细胞功能缺陷是2 型糖尿病特征性病理生理学改变，其中胰岛素抵抗是2 型糖尿病的发病机制中一重要环节，胰岛素抵抗主要表现之一为胰岛素敏感组织(肌肉、脂肪组织)葡萄糖摄取减少。格列喹酮作为第二代磺脲类药物，其主要作用是通过促进胰岛 1 引言 　　胰岛素抵抗和β细胞功能缺陷是2 型糖尿病特征性病理生理学改变，其中胰岛素抵抗是2 型糖尿病的发病机制中一重要环节，胰岛素抵抗主要表现之一为胰岛素敏感组织(肌肉、脂肪组织)葡萄糖摄取减少。格列喹酮作为第二代磺脲类药物，其主要作用是通过促进胰岛素分泌而控制血糖。随着学者们对磺脲类药物作用机理研究的深入，格列喹酮经典途径以外的降糖机制也逐渐引起大家的关注。Rinninger F 等[i]研究发现，格列喹酮可通过诱导体外培养的肝脏细胞糖原合成增加而发挥胰腺外作用，Marco 等[ii]研究发现格列喹酮可诱导3T3-L1成纤维细胞PPARγ 靶基因GLUT4 的表达，其作用效应与吡格列酮相近。本研究旨在通过体外葡萄糖摄取实验，观察格列喹酮对C2C12 细胞葡萄糖摄取作用及对胰岛素刺激的糖摄取的影响，并初步探讨格列喹酮的胰腺外降糖作用机制，为进一步阐明其临床作用提供新的实验依据。 　　2 材料与方法 　　2.1 材料 　　2.1.1 细胞株 　　小鼠成肌细胞株(C2C12) ,由德国乌尔姆大学刘跃飞教授惠赠。 　　2.1.2 主要试剂 　　DMEM 培养基（Gibco 产品，高糖型），胎牛血清（杭州四季青公司），马血清（Gibco产品），胰蛋白酶、DEPC、溴化乙锭（Sigma 公司），Trizol（Invitrogen 公司），逆转录酶MMLV 酶、Taq 酶（MBI 公司），GLUT4 及β-actin 引物由上海生工合成，100 bp LadderDNA Marker (Axyden 公司)，琼脂糖（Gibco 公司），3H -2-脱氧葡萄糖（Amersham 产品），格列喹酮（北京万辉双鹤药业），其它试剂均为国产分析纯。 　　2.2 方法 　　2.2.1 C2C12 的培养 　　加入含 10%胎牛血清的DMEM 培养基，置于37℃、含5％CO2 的培养箱中培养，隔日换液，待细胞生长至70％~80％融合时按1：4 传代。 　　2.2.2 C2C12 诱导分化 　　C2C12 细胞达80%左右融合时，传代接种于干预板中，待生长至80%~90%融合时，换用分化培养基（含2%马血清的DMEM 培养基）诱导分化(day0)，每24 小时换液一次；5-7天后90%以上成为成熟骨骼肌细胞用于实验。 　　2.2.3 葡萄糖氧化酶法检测细胞培养基中葡萄糖水平 　　细胞接种于 6 孔板，给药组在细胞分化后分别加入含10-5mol/L 的格列喹酮、10-7mol/L胰岛素以及10-5mol/L 格列喹酮+10-7mol/L 胰岛素的DMEM，同时设立空白组、不含细胞的DMEM 组。温育12 h 后再将培养基移出并用葡萄糖氧化酶法检测培养基中的含糖量。用DMEM 组含糖量的平均值减去其余各孔的含糖量，即是12h 各孔细胞的葡萄糖消耗量。收集细胞提取总RNA。 　　2.2.4 采用四甲基偶氮唑盐法评估格列喹酮对C2C12 细胞增殖的影响 　　取体外培养的C2C12 细胞，0.25%的胰酶溶液消化，制成单细胞悬液，1000 r/min 离心5min，以含10％胎牛血清的DMEM 培养基重悬。血细胞计数板进行细胞计数，细胞悬液密度为3.4×106 /L，接种至96 孔板，200μL/孔。实验共分4 组：空白对照组、10-7mol/L 胰岛素组、10-5mol/L 格列喹酮组、格列喹酮+胰岛素组，6 个平行孔/组。各组在37℃、5％CO2细胞培养箱内常规培养。待细胞融合率达80%且未出现细胞分化时，药物组分别向C2C12细胞中加入含对应浓度药物的无血清培养基，空白对照组则向C2C12 细胞中加入单纯无血清培养基。各组细胞干预12 h 后进行四甲基偶氮唑盐检测。即每孔加入5mg/mL 的四甲基偶氮唑盐液20μL，37℃继续培养4 h，镜下可见紫蓝色针状结晶。吸出孔内培养基后，每孔加入二甲基亚砜200μL，室温下将平板置于微孔板振荡器上振荡10 min，待结晶物溶解后，置于酶联免疫仪于490 nm 处检测各孔吸光度值。 　　2.2.5 3H -2-脱氧葡萄糖摄取实验 　　细胞接种于 24 孔板，给药组在细胞分化后分别加入含 10-5mol/L 的格列喹酮、10-5mol/L格列本脲的DMEM，同时设立空白组。用KRP 缓冲液洗涤3 次后，加入含10-7mol/L 胰岛素的KRP 缓冲液，在37℃