甲基亚砷酸对内皮型一氧化氮合酶磷酸化影响.docVIP

甲基亚砷酸对内皮型一氧化氮合酶磷酸化影响 StudyoneNOSphosphorylationinducedbymonomethylarsonousacid 　　LIBing,WANGYi,SUNGuifan. 　　DepartmentofOccupationalHealth,SchoolofPublicHealth,ChinaMedicalUniversity(Shenyang110001,China) 　　Abstract：ObjectiveToobservetheeffectsofmonomethylarsonousacid(MMAⅢ)oneNOSphosphorylationandreactiveoxygenspecies(ROS)generationinbovineaorticendothelialcells(BAEC).MethodsCulturedBAECwasexposedtoMMAⅢ(075μmol/L,0～15min)withoutorwithacetylcysteine(NAC)pretreatment(1mmol/L,2h),oriAsⅢ(100μmol/L,0～60min).WesternblotwasdonewiththespecificantibodiesforphosphoeNOSSer1179.IntracellularROSgenerationwasassessedwiththefluorescentprobe,2,7dichlorodihydrofluoresceindiacetate(H2DCFDA).ResultsMMAⅢ(075μmol/L)causedarapidincreaseinphosphorylatedeNOSSer1179at15minafterexposure(Plt;005).Incontrast,upto100μmol/LiAsⅢcausedtheincreaseofphosphorylatedeNOSSer1179at30min(Plt;005).MMAⅢstimulatedtheROSproductioninlivecells.BoththeMMAⅢinducedeNOSSer1179phosphorylationandROSgenerationwereblockedbyNACpretreatment(1mmol/L,2h).ConclusionMMAⅢexposurecaninduceROSgenerationandROSdependenteNOSphosphorylation. 　　Keywords：monomethylarsonousacid(MMAⅢ);arsenicpoison;eNOSphosphorylation;reactiveoxygenspecies(ROS) 　　无机砷的体内代谢中间产物甲基亚砷酸(MMAⅢ)比无机砷的细胞毒性和遗传毒性更强〔1〕，因此其毒性效应是砷中毒发病机制研究的一个新热点。研究表明，无机砷能够激活人类角质细胞和白血病Jurkat细胞的内皮型一氧化氮合酶(eNOS)磷酸化〔2，3〕，还可以诱导产生H2O2和超氧阴离子自由基(O#12539;-2)等活性氧自由基(ROS)〔4〕。本研究观察MMAⅢ对牛主动脉血管内皮细胞(BAEC)的eNOS磷酸化以及ROS产生的诱导作用。 　　1材料与方法 　　11主要试剂和仪器MMAⅢ(CH3AsO，获赠自加拿大CullenWR实验室)；亚砷酸钠(iAsⅢ，Wako)；N乙酰半胱氨酸(NAC，Wako)；二氯二氢二乙酰荧光素(H2DCFDA，MolecularProbes)；CO2细胞培养箱(Kendro)；电泳仪和转膜装置(Atto)；共聚焦荧光显微镜(Leicamicrosystems)。 　　12细胞培养BAEC培养于高糖培养基（DMEMF12)(sigma)，添加成分包括10％胎牛血清、10U/ml青霉素和100μg/ml链霉素、10U/ml肝素和5ng/ml成纤维细胞生长因子。37℃，5％CO2常规培养。 　　13eNOS磷酸化的westernblot分析暴露因素包括MMAⅢ(075μmol/L，0～15min)；iAsⅢ(100μmol／L，0～60min)；或NAC(1mmol／L)预处理2h后，再暴露于MMAⅢ(075μmol／L，0～15min)。加入细胞裂解液收获细胞悬液，低温离心后取上清冻存备用。十二烷基磺酸钠（SDS）聚丙烯酰胺凝胶后进行蛋白印迹（westernblot）分析。特异1 性一次抗体