(分子实验论文.docVIP

目的基因(COR)转入细菌细胞的方法及其检测 摘要:为了获得针对氨苄青霉素有抗性的基因,本实验进行了PGEMT-easy质粒和COR基因重组的初步研究。通过PCR 扩增,DNA重组 ,CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞，质粒的转化，质粒的提取，构建了重组子，通过PCR和酶切的方法检测,结果表明人工合成的氨苄青霉素抗性基因在大肠杆菌中表达并复制。 关键词:PCR扩增 质粒 基因重组 氨苄青霉素抗性基因 引言：目前对DNA重组的研究是微生物学等多方面的热点，尤其在医药工业和环境保护方面。通过人工定向改造基因，为人类的生活，生产需要提高了水平。例如利用发酵工业用大肠杆菌生产人的生长激素释放抑制因子，还有用转基因的小鼠产生长激素和青霉素都是DNA重组的应用。聚合酶链反应（polymerase chain reaction ），即PCR技术，是美国PE—Cetus公的科学家K.B.Mullis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。它的特异性是由两个人工合成的引物序列决定的。外源DNA与载体分子的连接就是DAN重组，重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、 ATP存在的连接缓存系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态，转化是指质粒DNA或以其为载体构建的重组子导入细菌的过程。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 1.1.1 菌株和质粒 大肠杆菌由农业与生物技术学院分子实验室提供，大肠杆( Escherichi a col i )DH5α、质粒PGEMT-easy也是由农业与生物技术学院分子实验室提供　 1.1.2 工具酶及分子生物学试剂 实验所需限制性内切酶，T4DNA连接酶，TapDNA聚合酶，4种dMixture等均由农业与生物技术学院分子实验室提供　 1.1.3　培养基　LB 培养基(10 g 胰蛋白胨,5 g 酵母提取物,10 g NaCl 定容至1 L ,p H 7. 0 ,固体培养基加15 %琼脂粉) 1.2 方法 1.2.1 PCR扩增目的基因COR 在0.2mL PCR管内25μL反应体系 dNTP混合物 2μL PCR buffer 5μL 引物1 0.5μL 引物2 0.5μL Tap酶 0.5μL DNA模版 1μL 加ddH2O 至25μL 按照94 ℃预变性2min,94 ℃变性1min,47℃退火1min,72℃延伸1min40s循环35次的程序进行目的基因的扩增。电泳检测并收回扩增产物。 1.2.2 DNA重组 配置连接体系 PCR扩增产物混合液 4μL PGEMT-easy质粒 1μL T4DNA连接酶 0.5μL 缓冲液 1μL 加ddH2O 至10μL 将上述混合液轻轻振荡，短暂离心后置于14℃恒温水浴过夜。这样即成连接后的产物，可以立即用来做感受态细胞的转化或置于4℃冰箱备用。 1.2.3 CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞 大肠杆菌感受态细胞的制备利用CaCl2，从大肠杆菌DH5α的平板上一个单菌落于3mL LB试管中，37℃培养，当OD600nm小于等于0.5时停止培养。取培养液1 mL转入1.5 mL 离心管中冰浴10—30 min后4000r/ min离心10 min(4℃)，倒净上清液用200μL冰冷的0.1mol/ LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞冰浴3 min后4000r/ min离心10 min(4℃)，倒净上清液，加入100μL冰冷的0.1mol/ LCaCl2溶液冰浴20-30 min后4000r/ min离心10 min(4℃)，弃上清液，加入100μL冰冷的0.1mol/ LCaCl2溶液，小心悬浮细胞冰浴片刻，即成了感受态细胞悬液。 1.2.4 质粒DNA的转化 制成的感受态细胞立即用于细胞转化加入连接体系（共7μL）摇匀冰浴20-30min后于42℃水浴热击90s再冰浴冷却2min。立即加入0.8-0.9 mL LB 培养基在37℃培养40-60 min后加800μL LB液体培养基，37℃培养1h（150r/h），将复苏后的细胞涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养皿中培养12-16h到出现菌落。 1.2.5 质粒DNA的提取 在3mL LB液体培养基中加入3μL氨苄青霉素，然后接入一个含PGE